• Chromatin remodeler
• DNA damage
• Gene regulation
• Genome stability
• T-cell lymphoma

Il linfoma a grandi cellule anaplastico (ALCL) è un tipo di linfoma non-Hodgkin derivante dai linfociti T periferici e costituisce circa il 2% di tutti i linfomi non-Hodgkin.
Gli ALCL sono suddivisi in quattro sottotipi: sistemico ALK+ e ALK-, associato alla protesi mammaria e cutaneo primario.
L’ ALCL ALK- costituisce il sottotipo più eterogeneo e complesso, per il quale sono limitate le terapie disponibili.
Recentemente, è diventato sempre più evidente che l’espressione alterata dei rimodellatori della cromatina è uno dei principali meccanismi coinvolti nella trasformazione degli ALCL. In particolare, HELLS, un rimodellatore della cromatina ATP-dipendente appartenente alla famiglia degli SWI/SNF, è frequentemente alterato in diversi contesti tumorali, dove regola la stabilità genomica. Sebbene sia stata ipotizzata una funzione trascrizionale di HELLS nei tumori, il meccanismo attraverso cui regola la trascrizione negli ALCL rimane ancora da chiarire.
I nostri dati preliminari suggeriscono che negli ALCL ALK-, HELLS possa favorire l'espressione genica attraverso due modalità distinte: agevolando il reclutamento della RNA polimerasi II (RNAPII) su geni implicati nella regolazione immunitaria e supportando l'elongazione attiva della RNAPII nei geni cruciali per la progressione tumorale.
Lo scopo della tesi è stato quello di caratterizzare il meccanismo molecolare attraverso il quale HELLS promuove l’elongazione della RNAPII nei linfomi ALCL ALK-.
A tal proposito, abbiamo analizzato la distribuzione della forma attiva della RNAPII (ser2P) mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da PCR quantitativa (qPCR). I dati ottenuti confermano uno stallo della RNAPII nelle regioni a valle del sito di inizio della trascrizione nelle cellule deplete per HELLS mediante l’uso di specifici short harpin (sh) RNAs. Poiché è noto che l'arresto della RNAPII è associato alla formazione di R-loop, cioè ibridi di DNA e RNA, abbiamo ipotizzato che l’assenza di HELLS possa indurre la formazione di R-loops. Per verificare questa ipotesi, abbiamo condotto un’immunofluorescenza (IF), rilevando un aumento di R-loops nelle linee di linfoma ALCL ALK- in assenza di HELLS. Successivamente, attraverso un saggio di prossimità (PLA) abbiamo dimostrato la prossimità fisica (<40nm) tra gli R-loops e la forma attiva della RNAPII ipotizzando che gli R-loops si possano formare sugli stessi siti genomici caratterizzati dallo stallo della RNAPII. Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo eseguito un'immunoprecipitazione degli ibridi DNA-RNA (DRIP) seguito da qPCR. L’analisi dei risultati ottenuti conferma la presenza di R-loops sui siti di stallo della RNAPII precedentemente individuati, indicando che HELLS favorisce la progressione della RNAPII attraverso la rimozione degli R-loops.
Parallelamente, abbiamo approfondito il ruolo di HELLS nei processi collegati al danno al DNA. Nelle linee ALCL ALK-, la deplezione di HELLS si accompagna ad aumento significativo del danno al DNA valutato mediante saggi di IF per il marcatore yH2AX. Per valutare la relazione tra gli R-loops e la presenza del danno al DNA, abbiamo over-espresso l’RNAseH1, un enzima in grado di rimuovere selettivamente gli R-loops. Abbiamo osservato una riduzione del danno al DNA associato all’azione dell’RNAseH1 nelle linee cellulari deplete per HELLS rispetto alle cellule di controllo. I dati indicano che la persistenza di R-loops promuove il danno al DNA. Successivamente, mediante ChIP-qPCR, abbiamo dimostrato che il danno al DNA coinvolge le stesse regioni genomiche interessate dall’accumulo degli R-loops.
In conclusione, abbiamo dimostrato che HELLS regola la stabilità genomica negli ALCL ALK- diventando un promettente bersaglio per le terapie antitumorali.

Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL) is a type of non-Hodgkin lymphoma that originates from peripheral T lymphocytes, accounting for about 2% of all non-Hodgkin lymphomas. ALCLs can be further classified into four subtypes, namely anaplastic lymphoma kinase (ALK)-positive ALCL (ALK+ALCL), ALK-negative (ALK-)ALCL (ALK-ALCL), breast implant-associated (BIA)-ALCL (BIA-ALCL), and primary cutaneous ALCL (pcALCL). ALK-ALCL is the most heterogeneous and complex subtype, with limited therapeutic options. Recent research has suggested that altered expression of chromatin remodelers is one of the main mechanisms involved in ALCL transformation. Specifically, HELLS, an ATP-dependent chromatin remodeler belonging to the SWI/SNF family, is frequently deregulated in various tumor contexts, where it regulates genomic stability. Although a transcriptional function of HELLS in tumors has been hypothesized, the mechanism through which it regulates transcription in ALCL remains unclear. Our preliminary data suggest that HELLS may promote gene expression in ALK-ALCL through two distinct modalities: facilitating the recruitment of RNA polymerase II (RNAPII) on genes involved in immune regulation and supporting active elongation of RNAPII on genes crucial for tumor progression. This thesis aimed to characterize the molecular mechanism through which HELLS promotes RNAPII elongation in ALK-ALCL. In this regard, we analyzed the distribution of the active form of RNAPII (ser2P) using chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by quantitative PCR (qPCR). The data obtained confirm that RNAPII stalls downstream of the transcription start site (TSS) in cells depleted of HELLS using specific short hairpin (sh) RNAs. Since RNAPII arrest is associated with R-loops formation, i.e., DNA-RNA hybrids, we hypothesized that HELLS deficiency might induce R-loops formation. To test this hypothesis, we conducted immunofluorescence (IF), detecting an increase in R-loops in ALK-ALCL cell lines without HELLS. Subsequently, through a proximity ligation assay (PLA), we demonstrated physical proximity (<40 nm) between R-loops and the active form of RNAPII, suggesting that R-loops may form at the same genomic sites characterized by RNAPII stalling. To demonstrate this hypothesis, we performed DNA-RNA hybrid immunoprecipitation (DRIP) followed by qPCR. Our analysis confirms the presence of R-loops at RNAPII stalling sites previously identified, indicating that HELLS promotes RNAPII progression by removing R-loops. Concurrently, we investigated the role of HELLS in DNA damage processes. In ALK-ALCL cell lines, depletion of HELLS leads to a significant increase in DNA damage, as measured by IF assays for the yH2AX marker. To determine the relationship between R-loops and DNA damage, we overexpressed RNAseH1, an enzyme capable of selectively removing R-loops. We observed a reduction in DNA damage associated with RNAseH1 action in HELLS-depleted cell lines compared to control cells. These findings suggest that persistent R-loops promote DNA damage. Subsequently, by ChIP-qPCR, we demonstrated that DNA damage involves the same genomic regions affected by R-loop accumulation. In conclusion, we have shown that HELLS plays a crucial role in regulating genomic stability in ALK-ALCL, making it a promising target for anti-tumor therapies.