Riassunto analitico
La retinite pigmentosa (RP) è una patologia geneticamente eterogenea che si manifesta con la progressiva degenerazione dei fotorecettori. Tra gli eventi che promuovono la morte dei fotorecettori si ha l’eccesso di stress ossidativo, elevate concentrazioni intracellulari di cGMP e Ca2+, ed alterazioni metaboliche. Anche disfunzioni mitocondriali sono indici di stress cellulare e possono indurre l’attivazione di processi di morte cellulare.
La retina tra tutti i tessuti nervosi è quello con le più alte richieste metaboliche. In particolare, i fotorecettori sono il tipo cellulare con il più elevato consumo energetico. Nonostante la presenza di ossigeno, la pathway di fosforilazione ossidativa è poco utilizzata dai fotorecettori ma il processo di produzione energetica prediletto è la glicolisi aerobica. Questo cambiamento metabolico prende il nome di “effetto di Warburg”.
L’esochinasi 2 (HK2) è l’enzima che catalizza la prima reazione limitante della glicolisi aerobica, che è la fosforilazione del glucosio in glucosio-6-fosfato. HK2 previene inoltre l’attivazione di processi apoptotici interagendo con il canale anionico voltaggio dipendente (VDAC) a livello della membrana mitocondriale. In particolare, HK2 impedisce allo stesso VDAC formare il poro di transizione della permeabilità mitocondriale (mtPTP) che promuovebbe la permeabilizzazione e la distruzione della membrana mitocondriale inducendo segnali apoptotici. Questo evidenzia l’importanza di Hk2 nella regolazione del metabolismo cellulare e della sopravvivenza.
È già stato dimostrato in modelli animali di RP che la progressione della degenerazione dei fotorecettori si associa a una diminuzione della glicolisi aerobica in favore del ciclo di Krebs e della fosforilazione ossidativa. Nel nostro laboratorio è stato osservata anche la downregolazione di Hk2 in tre modelli di RP.
Lo scopo di questo progetto è stato quello di investigare se fosse possibile proteggere il modello cellulare di RP, 661W-A11 trattato con Zaprinast, tramite la promozione dell’espressione di Hk2.
Per questo è stato generato e caratterizzato un clone stabile di 661W-A11 esprimente il fattore regolatorio del sistema inducibile Tet-ON, rtTA_M2. L’integrazione stabile del gene rtTA_M2, nel genoma delle cellule 661W-A11, è stata ottenuta tramite trasduzione con un vettore lentivirale self inattivante prodotto con cellule HEK293T. Sono state poi ottimizzate le condizioni di induzione del sistema con doxyciclina per il clone selezionato chiamato “A11-rtTA-D6”
Successivamente, la sequenza della versione taggata del gene di interesse Hk2-HA è stata clonata nel plasmide pUHD_10.3 al fine di apporre Hk2-HA a valle del promotore inducibile Tet-O. Il plasmide ottenuto, pUHD-TetO-Hk2-HA, è stato poi trasfettato nelle cellule A11-rtTA-D6. Le cellule sono quindi state stressate con Zaprinast in presenza di doxyciclina per indurre l’espressione dei Hk2-HA. In tal modo è stato valutato in contributo dell’espressione di Hk2 nella vitalità cellulare.
Lo scopo finale è stato quello di ottenere una linea cellulare in cui fosse facilmente inducibile l’espressione di HK2-HA per valutare l’effetto che ha l’overespressione di Hk2 durante la degenerazione del fotorecettore.
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Abstract
Retinitis pigmentosa is a form of inherited retinal degeneration. Photoreceptor’s progressive cell death is induced by many events like increased oxidative stress, high intracellular levels of calcium and cGMP, metabolic dysfunctions and alterations in mitochondrial function. Among the different parts of the nervous tissues, the retina has the highest energy requirements with photoreceptors accounting for the largest energy demand. Despite oxygen presence, photoreceptors barely use oxidative phosphorylation to produce energy, and aerobic glycolysis is the major metabolic pathway. This metabolic switch is named Warburg effect.
The enzyme Hexokinase 2 (HK2) catalyzes the first-rate limiting reaction of aerobic glycolysis, which is the phosphorylation of glucose into glucose-6-phosphate. Moreover, HK2 interaction with voltage dependent anion channels prevents the formation of the mitochondrial permeability transition pore (mtPTP). Otherwise, mtPTP formation would promote mitochondrial membrane permeabilization and disruption leading to proapoptotic signals. This highlights the relevance of HK2 in the regulation of cellular metabolism and survival.
It’s been widely demonstrated in RP animal models that progressive degeneration of photoreceptors affects aerobic glycolysis. Indeed, progression of the disease is associated with increase in the tricarboxylic acid cycle and oxidative phosphorylation in photoreceptors. In our laboratory, we also detected a downregulation of Hk2 gene in three models of RP.
The aim of this study was to investigate whether we could protect the 661W-A11 RP cellular model from the stress induced by a Zaprinast by ectopically expressed Hk2.
With that aim, an inducible system for controlling Hk2 gene expression was developed. rtTa_M2 gene, which is the crucial component of the Tet-On gene expression system, was stably integrated in the 661W-A11 cell genome using a self-inactivating lentiviral vector. Subsequently, a clone called “A11-rtTA-D6” with a stable expression of the rtTA_M2 gene was isolated and doxycycline concentration to induce the gene expression was optimized.
The next step required cloning the tagged version of the protein of interest HK2-HA inside the plasmid pUHD_10.3 that contains the inducible promoter for rtTA TeT-O. In this way the HK2-HA construct was positioned downstream of the TeT-O promoter and the derived plasmid pUHD-TeTO-Hk2-HA plasmid was used to transfect the A11-rtTA-D6 cells. To evaluate the protective effect of HK2 on our RP cellular model, the transfected A11-rtTA-D6 cells were stressed with Zaprinast in the presence of doxycycline to induce Hk2-HA expression.
The final purpose was to obtain a cell line in which HK2-HA expression could be easily induced, to better evaluate Hk2 overexpression effects during photoreceptor degeneration.
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