• CRISPR/Cas9
• Genome Editing
• Primary T cells
• T cell receptor
• Tumor cells

CRISPR/Cas9 technology is the most widely used genome-editing tool. It is employed to induce a targeted double strand break (DSB) into the genome, which could be repaired either by non-homologous end-joining (NHEJ) mechanism, an error prone process leading to knock-out of gene expression, or by homology-directed repair (HDR) in presence of a DNA donor template to knock-in a desired sequence into a targeted genomic locus.
In the last years, CRISPR/Cas9 has been applied in the cancer immunotherapy field to arm immune cells and induce specific immune responses against cancer. Several strategies rely on the engineering of T cells, such as the orthotopic T cell receptor (TCR) replacement, which consists in the substitution of the native TCR with a tumor antigen-specific one to provide a targeted tumor action.
In this thesis, CRISPR/Cas9 system was exploited to perform an orthotopic TCR replacement in primary T cells to switch off the expression of endogenous TCR and simultaneously induce the knock-in of DNA donor templates for therapeutic TCRs specific for NY-ESO-1 or MAGE-A1. These two cancer/testis antigens are highly expressed in a wide range of cancers, such as melanoma and lung cancer, thus represent good candidates to target solid tumors. To this aim, two DNA templates for each antigen were generated, the first one carrying the full TCR β-chain and part of TCR α-chain specific for NY-ESO-1 or MAGE-A1 TCR, while the second one including both the full TCR αβ chains. In each DNA donor, the TCR sequences are flanked by left and right homology arms that allow the precise insertion into the CRISPR/Cas9-edited locus.
To knock out the endogenous receptor and induce the orthotopic replacement with NY-ESO-1- or MAGE-A1-specific TCRs, ribonucleoproteins (RNP) of Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) specific for α chain locus (TRAC) and coupled to the HR donor template, were delivered into T cells isolated from healthy donor’s blood samples. To reduce the mispairing possibility among the transgenic and the endogenous TCR αβ-chains, the knock-out of TCR β chain was also performed with SpCas9 RNP targeting TRBC1 and TRBC2 exon 1. The editing efficiency in the TRAC locus was higher than 90%, and nearly 50% for both TRBC1 and TRBC2. The specific insertion of the DNA donor templates was evaluated by target integration-PCR amplifying the genome-donor junction sites. Possible translocation events among TRAC and TRBC loci occurring in the multiplex editing action were also analyzed by PCR and confirmed by sequencing.
To evaluate the transgenic TCR expression on the T cell surface, flow cytometry analysis of engineered T cells stained with NY-ESO-1- or MAGE-A1-loaded MHC-I tetramers was performed. These allow to show that, after treatment with RNPs and DNA donor templates, up to 5% of T cells express TCR on their surface. More importantly, the vast majority of TCR+ cells expressed NY-ESO-1- or MAGE-A1-specific TCRs (69% and 83% TCR+ CD8+ cells, respectively). Engineered T cells were evaluated for their killing activity and cytokine release ability in co-culture experiments with cells expressing NY-ESO-1 or MAGE-A1 antigens. Flow cytometry analyses showed that engineered T cells are able to activate and produce pro-inflammatory cytokines (IFNγ, IL-2 and TNFα) in response to target cells and, kill cells expressing tumor antigens.
In conclusion, this thesis represents a proof-of-principle application of CRISPR/Cas9 system for orthotopic T cell replacement to enable primary T cells to respond to and kill cells expressing tumor antigens.

La tecnologia di CRISPR/Cas9 è la più utilizzata nel campo del genome-editing. Questa viene sfruttata per generare una rottura a doppio filamento nel genoma (DSB), che può essere riparato, con il meccanismo di ricombinazione non omologa (NHEJ), un processo soggetto ad errori che possono portare al knockout di un gene, oppure, in presenza di un filamento di DNA stampo, può avvenire una ricombinazione omologa (HDR). Negli ultimi anni CRISPR/Cas9 è stato applicato nell’immunoterapia con lo scopo di stimolare il sistema immunitario ad agire contro i tumori. I linfociti T sono stati molto studiati e una delle maggiori applicazioni è la sostituzione ortotopica del loro recettore endogeno con uno specifico per bersagliare antigeni tumorali e generare una risposta diretta contro il tumore. In questa tesi il sistema di CRISPR/Cas9 è stato sfruttato per fare una sostituzione ortotopica in linfociti T primari così da spegnere l’espressione del TCR endogeno e indurre quella di TCR terapeutici anti NY-ESO-1 e MAGE-A1, antigeni vastamente espressi da diversi tumori, come melanoma e tumore al polmone. Per raggiungere questo scopo, sono stati utilizzati due filamenti di DNA stampo per ognuno dei due antigeni, il primo porta con sé l’informazione per un TCR composto dall’intera catena β e parte della catena α specifiche per NY-ESO-1 o MAGE-A1, mentre il secondo include entrambe le catene αβ specifiche per questi TCR. Ogni filamento di DNA utilizzato come stampo è fiancheggiato da delle sequenze di omologia con il genoma per favorire l’inserzione del frammento nel locus di interesse. Per spegnere l’espressione del recettore endogeno, e indurne la sostituzione con uno specifico anti NY-ESO-1 o MAGE-A1, è stata utilizzata una ribonucleoproteina (RNP), derivata dallo Streptococcus pyogenes (SpCas9), specifica per il locus genomico della catena α (TRAC), accoppiata con un filamento stampo per la ricombinazione omologa. Per ridurre la possibilità di mal appaiamento tra le catene del TCR transgeniche con quelle endogene, è stata utilizzata una SpCas9 RNP specifica per bersagliare l’esone 1 di TRBC1 e TRBC2. È stata ottenuta una modificazione del locus TRAC maggiore del 90%, e vicina al 50% per entrambi TRBC1 e TRBC2. L’inserzione specifica del filamento di DNA usato come stampo, è stata valutata tramite una PCR in grado di amplificare la giunzione tra il genoma e il filamento donatore. Inoltre, tramite PCR e successivamente tramite sequenziamento, sono stati valutati i possibili traslocazioni tra i siti TRAC e TRBC che possono avvenire durante queste azioni di modificazione. Per valutare l’espressione del TCR transgenico sulla superficie cellulare sono state effettuate delle analisi cito-fluorimetriche marcando le cellule ingegnerizzate con dei tetrameri MHC-I caricati con NY-ESO-1 o MAGE-A1. Queste hanno mostrato che più del 5% delle cellule T esprimono un TCR sulla loro superficie, ma soprattutto che la maggior parte delle cellule TCR+ esprimono i TCR specifici per NY-ESO-1 o MAGE-A1 (il 69% e l’83% delle cellule CD8+). Le cellule T ingegnerizzate sono poi state valutate per la loro attività citotossica e la loro abilità nel rilasciare citochine quando messe in co-cultura con cellule esprimenti gli antigeni NY-ESO-1 o MAGE-A1. Le analisi cito-fluorimetriche hanno mostrato che le cellule ingegnerizzate sono in grado di produrre citochine (IFNγ, IL-2 e TNFα) in risposta alle cellule target e, inoltre, che sono in grado di uccidere cellule esprimenti antigeni tumorali attivando una risposta pro-infiammatoria. In conclusione, questa tesi è una dimostrazione che il sistema CRISPR/Cas9 è applicabile alla sostituzione ortotopica del recettore delle cellule T per permettere alle cellule T primarie di rispondere, e di uccidere, cellule esprimenti antigeni tumorali.