Riassunto analitico
Studi precedenti hanno riportato l'uso diretto sull’uomo di trachee ingegnerizzate in vitro e in vivo senza sufficienti ricerche preliminari ed approfondimenti, causando morti ingiustificate. In questa tesi abbiamo deciso di provare ad individuare e controllare le variabili del trattamento, studiando la biologia del sistema.
Per ristabilire la continuità della trachea a seguito di lesioni, possono essere eseguite resezioni o ricostruzioni primarie. Tuttavia, queste procedure non danno esito positivo, nel caso in cui l'area compromessa sia circa la metà della lunghezza dell’organo nell’adulto e un terzo nel bambino. Questi limiti possono variare molto in base all’età, la corporatura, l’anatomia locale, la patologia ed eventuali trattamenti precedenti. Le lesioni di maggiore estensione, che non possono essere rimosse senza rischi, sono trattate invece con altre procedure quali aortopessia, stent tracheali, o tracheoplatica laterale. Questi trattamenti hanno un successo limitato. Ad oggi, non esiste un’opzione definitiva clinicamente praticabile, per pazienti con disordini segmentali di dimensioni importanti causati da stenosi tracheale congenita o resezione tumorale. In quest'ottica, l’obiettivo dell’ingegneria tessutale delle vie aeree è la ricostruzione mirata alla sostituzione dell’organo danneggiato, mimando la matrice extracellulare nativa (ECM) nella struttura e nella funzione, e favorendo l’homing e il differenziamento cellulare. Nell'ingegneria tissutale l'utilizzo di biomateriali come substrato è vincolato alla loro biocompatibilità, non immunogenicità, non cancerogenità e ad appropriate caratteristiche biomeccaniche. Inoltre questi materiali devono essere di lunga durata e idealmente provvedere o facilitare la riepitelizzazione evitando nel contempo dislocazioni, erosione, stenosi, accumuli di secrezioni e colonizzazioni batteriche.
Dati quindi il ruolo e la complessa funzione dell’ECM nativa, la generazione di una matrice sintetica alternativa attraverso polimerizzazione è particolamente difficile. Perciò, in questa tesi l’approccio selezionato è più conservativo e si è focalizzato sulla produzione di una matrice biologica, ottenuta dalla decellularizzazione di una trachea xenogenica, in seguito ricellularizzata con cheratinociti umani. Nel processo di decellularizzazione le cellule del tessuto sono eliminate attraverso metodi fisici, chimici o enzimatici, mentre l’architettura della ECM rimane intatta e può potenzialmente così essere riseminata con le cellule del ricevente. La trachea porcina selezionata, è stata lavata, tagliata e sottoposta a tre differenti protocolli di decellularizzazione in condizioni statiche e dinamiche in modo da identificare l’approccio più appropriato. In seguito sui substrati appena preparati sono stati seminati fibroblasti inattivati, 3T3, e cheratinociti umani.
I campioni sono stati mantenuti in coltura immersa per sette giorni e in emersione per quindici. Sono state quindi analizzate la attività metabolica, l’architettura (attraverso H&E) e le proteine tessutali (attraverso immunofluorescenza). I dati hanno confermato la formazione dell’epitelio sul substrato per due dei tre protocolli testati. Questi risultati evidenziano la corretta adesione cellulare e l’adeguatezza della matrice naturale xenogenica prodotta per l’ingegneria tissutale, rendendo ipotizzabili futuri trapianti di trachea con questo approccio. Una volta che il modello e il pannello delle analisi è stato ottenuto, è stato impiegato per caratterizzare cellule bronchiali di pazienti affetti da fibrosi idiopatica, fibrosi cistica (omozigoti per dF508 ed eterozigoti per dF508/2789 +5G>A). E' stata esaminata la loro capacità di mantenere l’espressione di marcatori della staminalità, della proliferazione, del differenziamento e dell’epitelio respiratorio. Queste scoperte forniranno modelli umani fisiologici e patologici, utili per testare nuovi trattamenti.
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Abstract
Previous researches have experimented directly and hastily on human causing unjustified deaths without preliminary and depth experimentations in vitro and in vivo. Thus we decided to start again from the basic and fundamental research while finding and controlling the variables of the treatment.
Tracheal lesions can be resected and primary reconstruction effected to restore continuity. However, the general limits for resections are about half the tracheal length, approximately 6 cm, in adults and one third in small children. Limits can vary also widely on age, body build, local anatomy, pathology, and prior treatment. Lengthier lesions that can’t be removed safely are treated with other therapies including aortopexy, tracheal stenting, T tubes, or slide tracheoplasty. However, these procedures have mixed levels of success. To date, there is no clinically viable option available for patients with long segmental disorders due in most part by untreatable congenital tracheal stenosis or tumours resection. The view is that the tissue-engineered airway will replace the damaged organ, mimicking the native extracellular matrix (ECM) in structure and function, while providing support and encouraging cell homing, differentiation and proliferation. If biomaterials are to be utilized, these materials should be cell compatible, non-toxic, non-immunogenic, and non-cancerogenic. Thus, the tissue must be a permanent substitute and ideally provide or facilitate epithelial resurfacing while having to resist dislocation, erosion, stenosis, accumulation of secretions, and bacterial colonization.
Due to the multifaceted role and function of the native ECM, it’s challenging the generation of a synthetic alternative through polymerization. Therefore, in this thesis, the selected and more conservative approach focused on the production of the biological matrix, obtained by xenogeneic trachea decellularization, and followed by recellularization with human keratinocytes. In the decellularization process tissue cells are discharged from the organ via physical, chemical or enzymatic means, while the architectural framework of the ECM remains intact that can potentially be reseeded with the recipient's own cells. The pig trachea has been cleaned and cut and then treated by three different decellularization protocols in static or dynamic condition in order to identify the most appropriate approach. Later, inactivated fibroblasts, 3T3, and human keratinocytes were seeded on the freshly prepared scaffolds.
The samples were kept in submerged culture for 7 days and in airlift for 15 days. We evaluated for all the samples their metabolic activity, specific architecture (by H&E) and tissue markers (by immunofluorescence). Data confirmed the formation of the epithelium of two out of the three protocols tested on the scaffolds.
These results highlight tan appropriate cell adhesion and the possible suitability for tissue engineering and for an achievable tracheal replacement.
Once this model and panel of analyses were obtained, they were applied to the characterization of bronchial human lineage from patients affected by idiopathic fibrosis, cystic fibrosis (dF508 homozygous and dF508/2789 +5G>A heterozygous). We evaluate their capability to maintain expression of epithelial stemness/proliferation markers, differentiation markers and airway epithelial cells markers.
These findings will provide healthy and pathologic human models, useful for new treatment testing.
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