Riassunto analitico
High Throughput Screening (HTS) è un processo che consente di testare rapidamente grandi librerie chimiche attraverso saggi biochimici o cellulari miniaturizzati e automatizzati. Negli ultimi 20 anni, questo approccio è stato ampiamente utilizzato nella scoperta di farmaci per l’identificazione di chemical starting point for drug discovery. New Medicine for Trypanosomatidic Infections è un progetto mirato a scoprire potenziali farmaci per le patologie tripanosomatidiche siccome i farmaci esistenti sono associati a eccessiva tossicità e resistenza. Per ovviare ai problemi associati ai farmaci esistenti, sono stati identificati nuovi composti contro l'enzima folato dipendente pteridina reduttasi (PTR1). La proteina è stata identificata nel 2000 in parassiti di Leishmania resistenti al metotressato e da studi knock out su Trypanosoma brucei e Leishmania major, ha rivelato il suo ruolo essenziale nel metabolismo di pterine e folati. PTR1 è stata successivamente caratterizzata e adottata o convalidata come target farmacologico in Leishmania e T.brucei e cruzi per la progettazione di nuovi inibitori come agenti singoli o in combinazione con composti antifolati o farmaci. Un certo numero di scaffold e inibitori chimici attorno a questi scaffold sono stati pubblicati, tuttavia non sono stati ancora scoperti inibitori che dimostrino l'efficacia in vivo. Il lavoro tuttora in corso è finalizzato all'identificazione degli inibitori della PTR1 che mostrino l'inibizione della crescita dei parassiti e l'efficacia in vivo. Il lavoro sperimentale della mia tesi svolto durante il mio stage presso Fraunhofer IME (Amburgo, Germania), in collaborazione con il laboratorio Drug Discovery and Biotechnology della Prof.ssa MP Costi (Unimore, Itlay), ha avuto come obiettivo l'identificazione di inibitori dell'enzima PTR1 mostranti attività e un profilo di sicurezza migliorato. Obiettivi secondari: ì. valutazione attraverso HTS di 219 composti con potenziale attività anti-PTR1, progettati e sintetizzati nel laboratorio di drug discovery e biotecnologie, Unimore durante il progetto NMTrypI. II. Valutare le proprietà di early toxicity, early ADME in vitro dei 219 composti. Per raggiungere gli obiettivi sopra descritti mi sono occupata di: 1. Impostare e ottimizzare il saggio in HTS. 2. Screening dei 219 composti verso l'enzima PTR1; 3. analizzare i dati. 4. Impostare il test HTS di citotossicità nella linea cellulare A549, blocco del canale hERG, inibizione dell'isoforma 2D6 CYP e la tossicità mitocondriale; 5. Screening di 219 composti; 6. Analizzare i dati. Risultati: Verso l’enzima TbPTR1, a 50μM 78 composti hanno rivelato un'inibizione di oltre il 60%, 29 una inibizione tra il 30% e il 60%. Nel test di citotossicità, i composti son stati testati in dose-risposta, alla concentrazione massima 83 composti hanno mostrato un'inibizione della crescita cellulare inferiore al 30%. 89 composti hanno rivelato a 10μM un'inibizione inferiore al 30% nei confronti di CYP2D6. Nei confronti del canale hERG a10μM 107 composti hanno mostrato un'attività di inibizione inferiore al 30%. Nei confronti della vitailità mitocondriale a 10μM 189 composti hanno mostrato meno del 30% di tossicità. Nel complesso questi dati mostrano un profilo interessante con tossicità limitata. In conclusione il saggio su PTR1 è stato impostato con successo e ha dato risultati riproducibili rispetto ad inibitore noto. Di 219 composti, alcuni hanno mostrato effetto inibitorio nanomolare. Per completare lo screening deve essere eseguita la valutazione su LmPTR1. Il profilo di ADMETox deve essere completato attraverso la valutazione di altre isoforme CYP(3A4; 1A2; 2C9; 2C19). La valutazione della SAR potrà condurre verso l’ottimizzazione del profilo inibitorio e di selettività dei composti. Questo lavoro di tesi è stato supportato da NMTrypI, FP7EU project, grant agreement no 603240
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Abstract
High Throughput Screening (HTS) is a process that permits the rapidly testing of large chemical libraries with miniaturized biochemical or cell-based assays in an automated manner. In the past 20 years, this approach has been extensively employed in drug discovery to identify chemical starting points for drug discovery. New Medicine for Trypanosomatidic Infections project aimed at discovering potential drugs for trypanosomatid diseases as the existing drugs are associated with excessive toxicity, increasing resistance and ineffective drug delivery. To overcome the problems of existing drugs, novel compounds were identified against the folate dependent enzyme Pteridine reductase (PTR1). The protein was identified in 2000 from methotrexate resistant Leishmania parasites. Knock out study on Trypanosoma brucei and Leishmania major revealed its essential role in pterins and folates metabolism.PTR1 was subsequently characterized and adopted or validated as drug target in Leishmania, T.brucei and T.cruzi for the design of new inhibitors as single agents or in combinations with antifolate compounds or drugs. A number of chemical scaffolds and inhibitors around those scaffold have been published, however no inhibitors showing in vivo efficacy have been discovered yet. Therefore, the ongoing work in the field is aimed at the identification of PTR1 inhibitors that shows inhibition of parasite growth and in vivo efficacy.The experimental work of my thesis performed during my internship at Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME (Hamburg, Germany), in collaboration with Drug Discovery and Biotechnology laboratory of Prof. M. P. Costi (Unimore, Itlay), had as objective the identification of PTR1 inhibitors showing high potencies and improved safety profile. The secondary objective were: ì. to develop an HTS evaluation of 219 compounds with potential anti-PTR1 activity, designed and synthesized in Drug discovery and biotechnology laboratory at Unimore during the NMTrypI project. ìì. Evaluate early toxicity properties, in vitro initial ADME profile, of the 219 compounds. To achieve the above described objectives I performed the following experiments:1. Set-up and optimize the HTS experiment at Fraunofher 2. Screen the 219 compounds against PTR1 enzyme; 3. analyse the data. 4. Set-up the HTS cytotoxicity assay in A549 cell-line, hERG blockage, CYP isoform inhibition (2D6) and mitochondrial toxicity; 5. Screen the 219 compounds; 6. Analyse the data. Results: In TbPTR1 inhibition experiments at 50µM 78 compounds revealed more than 60% inhibition, 29 compounds 30%-60% inhibitions. Dose response evaluation showed few compounds with IC50 in nanomolar range. In cytotoxicity assay all compounds were tested in dose response and at their maximum concentration 83 of 219 compounds showed clear profile with less than 30% grow inhibition. In CYP2D6 liability assay compounds were tested at 10µM and 89 compounds (40.64% of tested compounds) revealed less than 30% inhibition. hERG blockade assay revealed 107 compounds (48.86% of tested compounds) with less than 30% channel inhibition at 10µM. In mitochondria viability assay compounds were tested at 10 µM and 189 compounds (86.30% of tested compounds) showed more than 60% mitochondria viability. Overall these data show an interesting profile with limited toxicity. Conclusion: The PTR1 inhibition assay was successfully set-up and gave reproducible results respect to known inhibitor inhibition. Among the 219 compounds, a few showed nanoMolar inhibition effect. LmPTR1 inhibition should be performed to complete the screening. ADMETox profile should be completed through evaluation on the other CYP isoform (3A4; 1A2; 2C9; 2C19). Structure Activity Relationship evaluation will bring to final compounds optimization in activity and selectivity. This research program was supported by NMTrypI, FP7EU project under grant agreement no 603240
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