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La calcificazione patologica dei tessuti connettivi lassi o calcificazione ectopica (eC) è una frequente complicanza di patologie associate all’aumentare dell’età. Recenti studi hanno dimostrato che la deposizione di idrossiapatite non è il risultato di un processo passivo, ma di una dinamica interazione di fattori pro- e anti-calcificanti, anche se i meccanismi patogenetici non sono del tutto noti e non vi sono terapie efficaci. In questo contesto, patologie genetiche come lo Pseudoxanthoma elasticum (PXE), dovuta a mutazioni del gene ABCC6, rappresentano un modello interessante per studiare il ruolo di specifiche pathway molecolari nella progressiva mineralizzazione della componente elastica connettivale.
Lo scopo dell’attività di ricerca svolta nell’ambito del Dottorato è stato quello di contribuire ad una migliore caratterizzazione e comprensione del ruolo delle cellule mesenchimali nella patogenesi delle eC.
In primo luogo, i fibroblasti dermici isolati da soggetti sani e affetti da PXE sono stati coltivati in vitro, in presenza di stimoli pro-calcificanti. In questo ambiente, i fibroblasti modificano il loro fenotipo, alterando l’espressione di ENNP1/PC1 e di SPP1/OPN e l’attività di TNAP, inducendo la mineralizzazione. Nel PXE il rapporto tra fattori promuoventi e inibenti la disponibità di PPi (importante inibitore del processo di mineralizzazione) é spostasto in favore della calcificazione. Tuttavia, utilizzando cellule isolate da pazienti, dove la eC è già un processo in atto, resta da chiarire se i cambiamenti osservati siano la causa e/o la conseguenza della mineralizzazione. Uno studio su fibroblasti dermici ottenuti da topi transgenici Abcc6+/+ e Abcc6 -/-, di diversa età, indica che queste cellule mostrano modificazioni legate al genotipo, ossia rilevate già prima della comparsa delle eC (Ank e Opn), e modificazioni che possono rappresentare una risposta all’ambiente calcificato e/o una conseguenza del processo d’invecchiamento (O2-, Tnap e Bmp2).
Per comprendere quindi se le cellule, con l’invecchiamento, sono più prone alla eC, fibroblasti isolati da neonati (nHDF) e da adulti (aHDF) (modello d’invecchiamento ex vivo ) sono stati coltivati fino alla senescenza replicativa (modello d’invecchiamento in vitro) e mantenuti in coltura sia in mezzo standard che calcificante. I risultati dimostrano che l’età del donatore e la senescenza replicativa agiscono di concerto favorendo il processo di eC alterando il rapporto tra ANKH+ENPP1/TNAP e quindi la disponibilità di PPi.
È stato ipotizzato che le alterazioni morfo-funzionali età-dipendenti dei tessuti connettivi, incluse le eC, possono essere la conseguenza dell’ “inflammaging” in cui fattori solubili e cellule circolanti giocano un ruolo importante. Fibroblasti (nHDF e aHDF) sono stati coltivati in un mezzo pro-calcificante in presenza di lisati piastrinici umani (hPL). I risultati ottenuti indicano che hPL promuove la mineralizzazione, sebbene con differenze legate al donatore e/o ai metodi utilizzati per preparare il lisato. Inoltre, in pazienti affetti da eC, le cellule endoteliali mature e le cellule progenitrici (coinvolte nel processo di danno vascolare e di riparo, rispettivamente), identificate mediante un citofluorimetro di nuova generazione, mostrano uno “shift” verso un fenotipo osteoblasto-simile, suggerendo che queste cellule potrebbero essere utilizzate come marker di eC.
Infine, i fibroblasti sono stati coltivati all’interno di un gel di collagene arricchito in precipitati minerali ottenuti per via enzimatica. I gel sono stati caratterizzati mediante SEM-FEG e la morfologia/vitalità cellulare sono state valutate mediante microscopia a fluorescenza. Sono in corso ulteriori studi per valutare la risposta delle cellule mesenchimali in questo sistema 3D.

Pathologic calcification of soft connective tissues is a frequent complication of age-related disorders (i.e. atherosclerosis and kidney diseases). Recent studies have demonstrated that mineral precipitates are the result of a dynamic process due to an altered production of pro- and anti-calcifying factors by mesenchymal cells. Due to the complex interactions between cells, structural molecules, soluble factors and genes, pathomechanisms of ectopic calcification are still elusive and no specific therapies are available. Within this context, inherited diseases such as Pseudoxanthoma elasticum (PXE), due to ABCC6 gene mutations, represent interesting models to investigate specific molecular pathways. Aim of the present PhD dissertation was to better understand the role of mesenchymal cells in ectopic calcification. Firstly, dermal fibroblasts from PXE and healthy subjects were cultured in vitro in the presence of pro-calcifying stimuli. Under these environmental conditions, fibroblasts alter their phenotype changing ENPP1/PC1 and SPP1/OPN expression, as well as TNAP activity, thus favouring matrix mineralization. Interestingly, in PXE cells, the ratio between factors favouring and reducing PPi availability (i.e. one of the most powerful inhibitor of the mineralization process) exhibits a more pronounced shift towards a pro-calcifying balance. A still unsolved question is whether changes in fibroblasts’ behaviour are the cause and/or the consequences of the calcification process. Investigation on dermal fibroblasts from Abcc6 transgenic mice of different ages indicated that these cells exhibit modifications related to the genotype, being detected well before the development of calcification (Ank and Opn down-regulation), whereas other changes (O2- content, Tnap activity, and Bmp2 up-regulation) may represent a cellular response to the calcified environment and/or the consequence of the ageing process per se. To understand if cells are more responsive to ectopic calcification with ageing, thus contributing to the incidence of aberrant mineralization in the ageing population, fibroblasts from neonatal (nHDF) and adult (aHDF) subjects (ex-vivo aging model) were cultured up to replicative senescence (in vitro aging model) in standard and in calcifying media. Results demonstrated that donor's age and replicative senescence play in concert increasing the calcification process and altering the ANKH+ENPP1/TNAP ratio, thus affecting PPi availability. It could be suggested that age-related morpho-funcional alterations of soft connective tissues, including ectopic calcification, may be an additional consequence of “inflammaging”, where soluble factors as well as circulating cells play a role. Studies in which human platelet lysate was added to cultured nHDF and aHDF indicate that platelet-released factors promote mineralization, although with differences due to individual variability/susceptibility and/or to the methods used to prepare the lysate. In addition, in patients affected by vascular calcification, circulating endothelial and progenitor cells (i.e. cells involved in vascular damage and repair, respectively), being detected by high performance flow cytometer, exhibit a shift toward an osteoblast-like phenotype, thus paving the way for the clinical application of these cells as markers of vascular calcification. Finally, in order to provide a 3D substrate for the growth of cells in the presence of small dispersed mineral precipitates, an enzymatically calcified collagen gel has been developed and characterized by SEM-FEG, whereas cell viability and morphology were evaluated by fluorescence microscopy. Further studies are in progress to evaluate the response of mesenchymal cells in these culture conditions.