Riassunto analitico
Gli ormoni tiroidei (THs), prodotti e secreti dalla tiroide, svolgono numerose e importanti funzioni all'interno dell’organismo e sono fondamentali sia per lo sviluppo, che per il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale (SNC). Il loro rilascio e il mantenimento dei corretti livelli ematici sono sotto il controllo dell’asse ipotalamo-ipofisario. L’azione classica, genomica, degli ormoni tiroidei è mediata dal legame a recettori intracellulari (TRα, TRβ), e comporta la regolazione dell’espressione di geni target. Studi recenti hanno evidenziato un’azione più rapida, non genomica, di questi ormoni mediata dal legame a recettori di membrana (integrina αvβ3). In condizioni di sbilanciamento dei livelli ematici di ormoni tiroidei, si verificano profonde alterazioni nella struttura e nel funzionamento del SNC. Dato che esistono interazioni tra sistema GABAergico e sistema tiroideo molti dei disturbi neurologici associati a distiroidismi potrebbero essere correlati ad alterazioni della neurotrasmissione GABAergica. Per questa ragione abbiamo voluto studiare gli effetti modulatori dei THs sull’attività del recettore GABAA. Il GABA è il principale neurotrasmettitore inibitorio nel sistema nervoso e regola il network di attività dell’intero cervello. La trasmissione GABAergica può essere distinta in due modalità, fasica e tonica, che differiscono per ruolo funzionale e per il tipo di recettore GABAA coinvolto. L’inibizione fasica mediata dal GABA è dovuta all’attivazione transiente dei recettori GABAA sinaptici, mentre la trasmissione tonica è determinata dall’attivazione continua dei recettori GABAA extra-sinaptici. Lo scopo della mia tesi è stato quello di analizzare gli effetti non genomici dei THs su recettori GABAA nativi (espressi in colture neuronali primarie) e recettori GABAA ricombinanti (espressi in cellule HEK293 trasfettate con le subunità α1β2γ2, e α1β2δ). Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando la tecnica patch-clamp in configurazione whole-cell. I risultati ottenuti dimostrano che il T3 riduce le correnti evocate dal GABA, sia in neuroni corticali che in cellule HEK293 trasfettate con le subunità α1β2γ2 e α1β2δ del recettore GABAA, mentre il T4 modula negativamente le correnti GABA-evocate in colture corticali e in HEK293 α1β2δ, ma è inattivo in cellule che esprimono i recettori α1β2γ2. Un importante metabolita dei THs, inattivo sui recettori intracellulari, è il rT3 che pur non avendo alcun effetto sulle correnti evocate dal GABA, antagonizza l’effetto del T3 sulle correnti indotte dal GABA, ma solamente in cellule HEK293 che esprimono i recettori α1β2δ. Nel cervello sono presenti altri composti agonisti del recettore GABAA, tra questi taurina e β-alanina. I THs, testati in cellule HEK293 α1β2γ2, modulano le correnti evocate da taurina e β-alanina con un effetto simile a quello ottenuto sulle correnti evocate dal GABA. Conclusioni: dai risultati ottenuti si evince che la modulazione non genomica, esercitata dai THs sulle correnti evocate dal GABA, presenta una selettività d’azione, probabilmente dipendente dalla composizione in subunità del recettore GABAA. In particolare in HEK293 α1β2γ2 abbiamo ottenuto un profondo effetto del T3, mentre il T4 risulta inattivo, suggerendo che solo a livello di alcune sinapsi i due ormoni potrebbero avere un differente ruolo modulatorio.
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Abstract
Thyroid hormones (THs), produced and excreted from thyroid gland, officiates many important functions within organism and they are essential both for the development and correct functionality of central nervous system (CNS). THs release and maintenance of correct blood levels are under the control of hypothalamus-pituitary axis. The classical genomic action of thyroid hormones is mediated by binding of intracellular receptors (TRα, TRβ), and it leads to regulation of gene target expression. Recent studies has highlighted a more rapid action, called nongenomic, of these hormones through membranes receptors (integrin αvβ3) binding. THs levels imbalances produce deep changes in CNS structure and function. Since the interactions between GABAergic and thyroid system are very complex and bidirectional many neurological diseases associated with dysthyroidism could be correlated with alteration in GABAergic neurotransmission. For this reasons we have decided to study the modulatory effects of THs on GABAA receptor activity. GABA is the main inhibitory neurotransmitter in CNS and it regulates the network activity in the whole brain. GABAergic transmission can be distinguished in two modalities, phasic and tonic transmission, which differs in their functional role and in the GABAA receptor engaged. GABA phasic inhibition is due to transient activation of synaptic GABAA receptors, while tonic transmission is caused by continuous activation of extrasynaptic GABAA receptors.
The goal of my thesis has been to examine THs non genomic effects in native GABAA receptors (expressed in primary neuronal culture) and in recombinant GABAA receptors (expressed in HEK293 transfected with α1β2γ2 and α1β2δ subunits).
The experiments were performed using the patch-clamp technique in the whole-cell configuration.
Results: T3 reduced GABA-elicited currents both in cortical neurons and in HEK293 transfected either with α1β2γ2 or α1β2δ GABAA receptors subunits. T4 negatively modulate GABA currents in cortical culture and in HEK293 α1β2δ cells but it is inactive in α1β2γ2 cells. rT3 is an important THs metabolite which is inactive on intracellular receptors and has no effects also on GABAA receptors. Surprisingly rT3 is able to antagonize T3 effect on GABA-evoked currents in HEK293 that express α1β2δ receptors. In the brain there are other GABAA receptor agonists, such as taurine and β-alanine. We tested THs modulation of taurine and β-alanine induced currents in HEK293 α1β2γ and found that their effect was similar to that obtained on GABA- elicited currents.
Conclusion: THs non genomic modulation on GABA elicited currents displays selectivity in their action, likely due to subunit composition of GABAA receptor. In particular we underline in HEK293 expressing α1β2γ a strong effect of T3 while T4 was inactive, suggesting that also at the level of different brain synapses these two hormones play different modulatory roles.
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