Riassunto analitico
Il lavoro di questa tesi è basato sullo studio di proprietà biofisiche e biochimiche dell’enzima coproporfirina ferrochelatasi dal batterio gram-positivo Corynebacterium diphtheriae (CdCpfC), il quale sfrutta il pathway coproporfirina-dipendente per sintetizzare il gruppo eme. All’interno di questo pathway di biosintesi, l’enzima ferrochelatasi ha il ruolo di inserimento del Fe nel gruppo eme del substrato coproporfirina III (cpIII).
L’enzima ricombinante è stato inizialmente espresso in E. coli e purificato con tecniche di cromatografia di affinità (His-trap) e cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC).
La proteina ottenuta è stata caratterizzata tramite analisi HPLC-SEC-PDA-MALS, grazie alla quale è stata determinata la massa molare, e con spettroscopia UV-Vis. È stato possibile evidenziare la presenza di un cluster Fe-S.
Per studiare alcuni aspetti della reattività dalla ferrochelatasi, sono state effettuate varie titolazioni spettroscopiche UV-Vis. Inizialmente è stata studiata l’affinità dell’apo-proteina nei confronti del suo substrato fisiologico (coproporfirina III), del suo prodotto di reazione (coproeme) e del substrato fisiologico di altre ferrochelatasi (protoporfirina IX). Il binding della cpIII è stato studiato a diversi valori di pH.
Con la stessa tecnica è stata studiata l’affinità dell’enzima per lo ione Fe(II) a diversi pH e altri ioni metallici bivalenti, quali il cobalto, il rame e lo zinco. La titolazione UV-Vis con imidazolo ha permesso infine di evidenziare la stabilità della coordinazione del ferro nel sito attivo, tramite la sostituzione dei leganti assiali.
La cinetica di legame di Fe(II), Co(II) e imidazolo è stata studiata con la tecnica di spettroscopia UV-Vis stopped flow.
Il potenziale di riduzione del coproeme e del cluster Fe-S nell’enzima sono stati determinati tramite l’utilizzo della spettroelettrochimica UV-Vis.
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Abstract
The work of this thesis is based on the study of biophysical and biochemical properties of the enzyme coproporphyrin ferrochelatase from the gram-positive bacterium Corynebacterium diphtheriae (CdCpfC), which exploits the coproporphyrin-dependent pathway to synthesise the heme group. Within this biosynthesis pathway, the enzyme ferrochelatase has the role of inserting Fe into the heme group of the coproporphyrin III (cpIII) substrate.
The recombinant enzyme was initially expressed in E. coli and purified by affinity chromatography (His-trap) and size-exclusion chromatography (SEC) techniques.
The protein obtained was characterised by HPLC-SEC-PDA-MALS analysis, whereby the molar mass was determined, and by UV-Vis spectroscopy. It was possible to highlight the presence of an Fe-S cluster.
To study certain aspects of ferrochelatase reactivity, various UV-Vis spectroscopic titrations were carried out. Initially, the affinity of the apo-protein towards its physiological substrate (coproporphyrin III), its reaction product (coproheme) and the physiological substrate of other ferrochelatases (protoporphyrin IX) were studied. The binding of cpIII was studied at different pH values.
Using the same technique, the enzyme's affinity for the Fe(II) ion at different pH values and other bivalent metal ions such as cobalt, copper and zinc were investigated. Finally, UV-Vis titration with imidazole allowed the stability of iron coordination in the active site to be revealed by axial ligand substitution.
The binding kinetics of Fe(II), Co(II) and imidazole were studied using the UV-Vis stopped flow spectroscopy technique.
The reduction potential of the coproheme and Fe-S cluster in the enzyme was determined by using UV-Vis spectroelectrochemistry.
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