Riassunto analitico
Nella pratica clinica, la maggior parte dei trattamenti su base ormonale utilizzati nelle tecniche di riproduzione medicalmente assistita (ART), agiscono sull’attività del recettore (FSHR) dell’ormone follicolo-stimolante (FSH). Queste formulazioni pongono sfide significative in quanto alcune donne non rispondono a tali trattamenti, mentre altre sviluppano la sindrome da iperstimolazione ovarica (OHSS), una condizione molto grave e potenzialmente letale. È già stata dimostrata l’esistenza di nanoanticorpi, o VHH (frammento legante l’antigene di anticorpi a sola catena pesante) che possano legare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) o i loro ligandi, modulandone allostericamente l’attività: ciò sarebbe quindi applicabile a FSHR, in quanto è anch’esso un GPCR e, nella donna, è coinvolto nella regolazione della crescita e maturazione del follicolo ovarico.
In questo studio sono stati selezionati due gruppi principali di VHH, aventi come bersaglio FSHR o il suo ligando FSH: i VHH anti-FSHR sono stati selezionati combinando phage display, eseguito a partire da library immunitarie derivate dall’immunizzazione di lama, e approcci di high-throughput sequencing; i VHH anti-FSH invece sono stati selezionati utilizzando una library sintetica. Le capacità di legame dei nanoanticorpi selezionati ai rispettivi target sono state valutate mediante metodica enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), evidenziando la potenziale specificità di legame di alcuni dei candidati rispetto agli altri. Al contempo, sono stati eseguiti saggi funzionali tramite metodica Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), per valutare i livelli di adenosina monofosfato ciclica (cAMP) prodotto dalle cellule in seguito a trattamento con FSH e in presenza dei candidati VHH: alcuni dei nanoanticorpi anti-FSHR hanno dimostrato un’attività allosterica positiva (PAM) sulla produzione FSH-mediata di cAMP intracellulare, mentre alcuni dei candidati VHH anti-FSH hanno mostrato un’attività allosterica negativa (NAM). Nel complesso, i dati ottenuti hanno permesso di identificare dei VHH in grado di modulare l’attività di trasduzione del segnale mediata da FSH-FSHR. Nonostante sia necessaria un’ulteriore caratterizzazione degli stessi, il presente studio ha anche permesso di validare l’utilizzo di una strategia di screening che combina la selezione di potenziali binders che agiscano, al contempo, anche da modulatori, consentendo un ulteriore passo in avanti verso lo sviluppo di nuovi trattamenti da utilizzare in riproduzione assistita o come anticoncezionali.
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Abstract
Most hormonal treatments aiming at inducing reproduction in human medicine target the FSH-FSHR pathway. These treatments pose significant challenges, as some women do not respond to them, whereas others undergo ovarian hyperstimulation syndrome, a very serious, potentially life-threatening condition. It has previously been demonstrated that molecules can bind GPCRs, such as FSHR, or their ligands, and allosterically alter their signaling. In this study, we developed and selected two main groups of heavy-chain camelid antibody fragments, known as VHHs, targeting FSHR or its ligand FSH. Anti-FSHR VHHs were developed combining phage-display from immune libraries made from llama and high-throughput sequencing approaches. Anti-FSH VHHs were selected by screening a synthetic VHH library using similar approaches. The binding properties of these VHHs to their targets (FSHR or FSH) were therefore characterized through ELISA technique, demonstrating potential binding specificity for some candidate VHHs. In a complementary approach, functional assays were performed using the BRET technique to quantify FSH-induced cAMP levels produced in the presence of different VHHs. PAM effects (positive allosteric modulation) were observed with some anti-FSHR VHHs, while some anti-FSH candidates exhibited NAM effects (negative allosteric modulation). Overall, this work allowed the identification of interesting candidate VHHs for the modulation of the FSH-FSHR pathway that deserved further characterization. The data obtained validate the implementation of a medium throughput screening strategy combining the detection of potential binders and of pharmacological modulators. Overall, these data represent a step towards the development of innovative agents for non-hormonal contraception or for the treatment of infertility.
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