Riassunto analitico
Una delle principali cause di cecità nella popolazione è rappresentata da mutazioni all’interno del gene rodopsina (RHO). In particolare, è noto come mutazioni al livello di questo gene comportino il 30-40% dei casi di retinite pigmentosa autosomica dominante. Tra le varianti patogenetiche più ricorrenti in Europa troviamo mutazioni missenso a livello della coda C-terminale di rodopsina che determinano il cambiamento amminoacidico della Pro347 in Ser (c.1039 c>T, P347S-RHO) o Leu (c.1040 C>T, P347L-RHO). Secondo la classificazione fornita da Athanasiou e colleghi, queste varianti appartengono alla classe I, in quanto influenzano il traffico post-Golgi e il trasporto della rodopsina al segmento esterno dei fotorecettori. In particolare, in modelli murini transgenici (hRHO P347S) è stato possibile osservare come queste alterazioni causino la degenerazione dei fotorecettori e disfunzione mitocondriale. In questo studio proponiamo di utilizzare differenti Adenine Base Editors al fine di correggere in vitro le varianti P347S e P347L di rodopsina. Il base editing è uno strumento innovativo che sfrutta il sistema CRISPR/Cas, con lo scopo di generare cambiamenti a singolo nucleotide senza introdurre rotture del DNA a doppio filamento. In particolare, l’Adenine Base Editing è in grado di catalizzare la conversione dell’adenina in guanina. Al fine di correggere le mutazioni senza assistere ad alterazioni della sequenza codificante, sono state progettate strategie che utilizzano differenti tipologie di base editors: NG-ABE8e, SpRY-ABE8e ed eNme2-C-ABE8e. Per stabilire quale fosse l’editor più efficiente e valutare un possibile miglioramento del fenotipo, uno screening è stato condotto su cellule HeLa esprimenti, in modo stabile, la rodopsina wildtype o mutata. Al fine di indirizzare l’editing, sono stati disegnati due gRNA specifici per la mutazione P347S (S1 ed S2) e due gRNA diretti verso la mutazione P347L (L1 ed L2): per ogni condizione sperimentale ciascun base editor è stato veicolato in combinazione con un differente gRNA. L’efficienza e la specificità del base editing sono state testate mediante analisi BEAT, che ha evidenziato come l’editor NG-ABE8e sia altamente efficace nel correggere entrambe le mutazioni in esame. In particolare, NG-ABE8e ha mostrato un tasso di efficienza del 56% nel clone HeLa P347S quando co-somministrato con il gRNA S1, mentre un 49.8% nel clone HeLa P347L quando co-somministrato con il gRNA L2. È da notare come NG-ABE8e non abbia determinato conversioni di base a carico delle adenine adiacenti alle mutazioni puntiformi di interesse. Infine, è stato condotto un test di citotossicità sui cloni HeLa, esprimenti rodopsina, trattati e non con NG-ABE8e. Anche se non completamente corretti, i cloni di HeLa RHO P347S e P347L trattati con NG-ABE8e hanno mostrato un recupero del fenotipo. Da evidenziare come, il clone P347L trattato con NG-ABE8e abbia raggiunto livelli di citotossicità paragonabili a quelli del clone di HeLa esprimente la forma wildtype di rodopsina. In conclusione, i nostri esperimenti hanno mostrato come il sistema NG-ABE8e sia in grado di corregge efficacemente entrambe la mutazioni senza effetto bystander a livello della sequenza codificante di RHO. Inoltre, in seguito a base editing è stata osservata una notevole riduzione della citotossicità provocata dalle varianti C-terminali di rodopsina.
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Abstract
A common cause of blindness is represented by mutations in the Rhodopsin (RHO) gene, accounting for 30-40% of autosomal dominant Retinitis Pigmentosa (adRP). Notably, missense variants at C-terminal proline 347, such as p.Pro347Ser (c.1039 C>T, P347S-RHO) or p.Pro347Leu (c.1040 C>T, P347L-RHO), are among the most recurrent RHO pathogenetic variants in Europe. According to the classification provided by Athanasiou and colleagues, P347S and P347L variants are included in Class I mutations, as they affect the post-Golgi trafficking and the transport to outer segment (OS) leading to photoreceptor degeneration and mitochondrial dysfunction as observed in transgenic hRHO P347S mice. In this works we propose to use adenine base editors (ABE) to correct P347S-RHO or P347L-RHO variants in cell cultures, without introducing double-strand breaks (DSB). Base editing, a new tool of CRISPR/Cas system, can generate single-nucleotide changes in the DNA with no DSB. Specifically, adenine base editors selectively catalyse the conversion of adenine to guanine. We designed strategies based on NG-ABE8e, SprY-ABE8e or eNme2-C-ABE8e to specifically target rhodopsin mutations, with limited risk of perturbing the coding sequence.
After establishing HeLa clones stably expressing P347S, P347L, or WT RHO we in vitro screened the base editors in order to assess the best platform to achieve correction of the mutated nucleotide without off targets and evaluate a possible phenotypic rescue of the defect.
To test three ABE editors we designed four gRNAs: S1 and S2 tailored to the P347S mutation, and L1 and L2 specific for the P347L rhodopsin variant. Each ABE construct was tested in combination with a different gRNA at a time.
Efficiency and specificity of base editing were assessed by BEAT analysis and showed that NG-ABE8e was highly efficient in correcting RHO C-terminal mutations. Specifically, NG-ABE8e displayed an efficiency rate of 56% when co-delivered with S1 gRNA in the HeLa P347S clone and a 49.8% when co-delivered with L2 gRNA in the HeLa P347L clone. Notably, NG-ABE8e displayed no bystander A-to-G conversion in nucleotides nearby the point mutation, thereby preserving the integrity of the RHO coding sequence.
Finally, we performed a cytotoxicity assay on untreated and NG-ABE8e-edited HeLa clones expressing RHO variants. Although not fully corrected, P347S and P347L RHO clones treated with NG-ABE8e experienced a phenotypic rescue. Remarkably, the P347L edited clone, displayed cytotoxicity levels comparable to HeLa clone expressing WT RHO.
In conclusion, our experiments showed that the NG-ABE8e system efficiently corrects both RHO P347S and RHO P347L mutations without bystander effect in the RHO coding sequence. Moreover, we observed a remarkable reduction in cytotoxicity elicited by the C-terminal RHO variants.
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