Riassunto analitico
Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore aggressivo che insorge dalle cellule mesoteliali della pleura. Esiste un'associazione diretta tra l'esposizione all'amianto e lo sviluppo di MPM. I regimi chemioterapici standard consentono una sopravvivenza media compresa tra 8 e 14 mesi dalla diagnosi, rendendo il MPM una malattia orfana. Il Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) è una molecola che induce selettivamente l'apoptosi nelle cellule tumorali, risparmiando i tessuti sani. Nel nostro laboratorio abbiamo sviluppato una nuova forma solubile (s) di TRAIL con un potenziale citotossico in vitro e in vivo superiore alla molecola umana ricombinante (Spano, 2019). In questo studio abbiamo indagato il potenziale antitumorale di (s)TRAIL su cellule tumorali primarie isolate da pazienti affetti da MPM. Inoltre, sono indagati i meccanismi molecolari responsabili della resistenza a TRAIL nel MPM, con l'intento di sviluppare approcci combinatori in grado di migliorare la risposta al trattamento nelle cellule di MPM derivate dai pazienti. Da marzo 2023 fino a marzo 2024, sono stati reclutati per lo studio preclinico 7 pazienti affetti da MPM. Dopo aver ottenuto una sospensione di cellule primarie e convalidato le condizioni di coltura in vitro, tutti i campioni sono stati stabilizzati. Le colture primarie di MPM sono state caratterizzate mediante analisi FACS. Concentrandosi sui recettori TRAIL funzionali (DR4; DR5) e decoy (DcR1; DcR2), tutti i campioni hanno mostrato alti livelli di DR5 e bassi livelli di DcR1 e DcR2, ad eccezione del campione sarcomatoide con un'alta espressione di DcR1. Al fine di convalidare la capacità di attecchimento delle colture primarie di MPM, è stato eseguito uno studio in vivo, che ha dimostrato che 6 dei 7 campioni erano in grado di attecchire in un modello di topo NSG. Sono stati eseguiti saggi dose-risposta in vitro per valutare la citotossicità mediata da (s)TRAIL su tutti i campioni. Solo MESO#3 ha mostrato una ridotta sensibilità, dimostrando come la presenza di recettori attivanti e l'assenza di recettori inibitori è una condizione necessaria ma non sufficiente per indurre l'apoptosi mediata da TRAIL. Sulla base di questi risultati, per indagare ulteriormente l'espressione dei geni anti-apoptotici, è stata eseguita la Real Time-PCR. Il campione sarcomatoide presenta una sovra-espressione di XIAP e Bcl-2. Inoltre, poiché le cellule staminali del cancro (CSC) sono state descritte in letteratura come fattori di resistenza a TRAIL e a molti chemioterapici, abbiamo studiato la presenza di CSC nei nostri campioni. In particolare, MESO#6 ha mostrato un alto livello di CSC (35,9%). Per questo motivo, MESO#6 è stato oggetto di ulteriori studi in vitro. Su MESO#6 è stato condotto un approccio combinato con (s)TRAIL e Bortezomib in sistemi 2D e 3D. In entrambi i casi, il trattamento combinato ha portato a una significativa riduzione della vitalità cellulare del tumore, confermando la capacità di Bortezomib di invertire la resistenza a TRAIL in colture primarie di MPM. I nostri risultati hanno dimostrato la possibilità di isolare e stabilizzare in modo efficiente cellule tumorali primarie da campioni di MPM derivati da pazienti in sistemi di coltura cellulare 2D e 3D e in modelli in vivo. Nell’era della medicina personalizzata, questo rappresenta il primo passo per valutare l'impatto terapeutico di nuovi trattamenti. Inoltre, per la prima volta abbiamo studiato il potenziale effetto terapeutico della promettente molecola antitumorale (s)TRAIL contro il MPM, dimostrando che le cellule primarie di MPM mostrano un'elevata variabilità al trattamento con (s)TRAIL, indipendentemente dall'istotipo. Questa scarsa reattività è dovuta all'elevata espressione di geni anti-apoptotici e può essere ridotta dall’uso di chemioterapici come il Bortezomib associati a (s)TRAIL, suggerendo una futura trasferibilità delle terapie basate su TRAIL in clinica.
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Abstract
Malignant Pleural Mesothelioma (MPM) is an aggressive and deadly tumor arising from mesothelial cells of the pleura. There is a direct association between occupational or environmental exposure to asbestos and the development of MPM. Exposure is observed in up to 80% of cases. Standard chemotherapy regimens achieve a median overall survival ranging from 8 to 14 months from diagnosis, turning MPM a disease with an unmet medical need. Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) is a promising anti-tumor molecule due to its ability to selectively induce apoptosis in cancer cells, while sparing healthy tissue. In our laboratory, we have developed a new soluble (s) form of TRAIL characterized by higher in vitro and in vivo cytotoxic potential compared to the recombinant human molecule (Spano, 2019). Therefore, in this study, we intended to investigate the antitumor potential of (s)TRAIL on primary tumor cells isolated from MPM patients. Here, we will also identify molecular mechanisms accountable for TRAIL resistance in MPM with the intent of developing combinatorial approaches able to enhance treatment response in patient-derived MPM cells.
Starting from March 2023 and March 2024, a total of 7 patients affected by MPM were recruited for the pre-clinical study. After obtaining primary cell suspension and validating in vitro culture conditions, all samples were stabilized. Patient-derived MPM cell cultures were characterized by FACS analysis. Focusing on functional (DR4; DR5) and decoy (DcR1; DcR2) TRAIL receptors, all samples showed high levels of DR5 and low levels of DcR1 and DcR2 except for the sarcomatoid sample that had high expression of DcR1. Intending to validate the engraftment capacity of MPM primary cell culture, an in vivo study was performed, demonstrating that 6 out of 7 samples were able to engraft in a NSG mouse model. In vitro dose-response assays with soluble (s)TRAIL were performed to assess the impact of (s)TRAIL-mediated cytotoxicity on all patient-derived MPM samples. Only MESO#3 showed poor sensitivity demonstrating that the presence of activating receptors and the absence of inhibiting ones is a necessary but not sufficient condition to induce TRAIL-mediated apoptosis. Based on these results, to further investigate the expression of anti-apoptotic-related genes, RT-qPCR was performed. Sarcomatoid sample results in XIAP and Bcl-2 over-expression. In addition, since cancer stem cells (CSCs) have been described in literature as drivers of resistance to TRAIL and the majority of chemotherapeutic drugs, we investigated the CSCs’ presence in our samples. Particularly, MESO#6 showed a high level of CSCs (35.9%). For this reason, MESO#6 was evaluated to be a candidate for additional in vitro studies. A combinatory approach by using (s)TRAIL and Bortezomib treatment was conducted on MESO#6 in 2D and 3D systems. In both cases, the combinatory treatment led to significant cell viability reduction confirming the capacity of Bortezomib to revert TRAIL resistance in primary patient-derived MPM.
Our results demonstrated the possibility to efficiently isolate and stabilize primary tumor cells from patient-derived MPM samples both in 2D and 3D cell culture systems as well as in vivo models. This represents the first step to assessing the therapeutic impact of novel therapies in the era of personalized medicine. In addition, for the first time, we here investigated on the potential therapeutic effect of the promising novel anticancer molecule (s)TRAIL against MPM, demonstrating that primary patient-derived MPM cells show high variability to (s)TRAIL treatment regardless to the isotype. This poor responsiveness is essentially due to the high expression of anti-apoptotic-related genes and can be reverted by the association of chemotherapeutics such as Bortezomib to (s)TRAIL, thus confirming the potential transferability of TRAIL-based therapies in a future clinical setting for MPM patients.
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