Riassunto analitico
I polimeri di origine microbica hanno attirato grande attenzione nel corso dei decenni grazie alle loro proprietà eccezionali e alla loro versatilità. La cellulosa batterica e l'acido ialuronico sono due dei polimeri microbici più studiati. La cellulosa batterica consiste in una rete di nanofibre con caratteristiche uniche: elevata resistenza meccanica, capacità di trattenere l'acqua, biocompatibilità, elevata purezza e cristallinità. La cellulosa batterica è stata classificata come “Generally Recongnized As Safe” dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Tuttavia, la cellulosa batterica non possiede proprietà antibatteriche, antiossidanti e di guarigione delle ferite, limitandone l'applicazione. D'altra parte, l'acido ialuronico è un biomateriale interessante per la sua capacità di mantenere l'idratazione, la viscoelasticità, la mancanza di immunogenicità e tossicità. Inoltre, l'acido ialuronico ha effetti benefici sulla proliferazione delle cellule e sulla guarigione delle ferite. Per superare le limitazioni di entrambi i materiali, i ricercatori hanno combinato la cellulosa batterica e l'acido ialuronico attraverso strategie ex-situ, come l'immersione della cellulosa batterica in una soluzione di acido ialuronico e acqua. Tuttavia,sia la cellulosa batterica che la produzione di acido ialuronico sono ottenibili tramite fermentazione microbica. In questo contesto, una strategia denominata "co-cultura microbica" potrebbe essere sfruttata per incorporare l'acido ialuronico nella cellulosa batterica. Questa tesi mira a produrre un composito di cellulosa batterica e acido ialuronico attraverso una strategia di co-cultura microbica. In primo luogo, un gruppo di 17 ceppi di batteri acetici e 23 ceppi di batteri lattici sono stati sottoposti a screening per selezionare rispettivamente due ceppi alto-produttori di cellulosa batterica e due ceppi alto-produttori di acido ialuronico. I ceppi batterici utilizzati in questo studio provengono dalla Unimore Microbial Culture Collection e Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. Dopo la fase di screening, i ceppi selezionati sono stati messi in co-coltura attraverso 4 diverse combinazioni di batteri acetici e lattici. È stata osservata una maggiore resa di cellulosa batterica dopo 72 ore di incubazione di ciascuna combinazione di batteri acetici e batteri lattici rispetto alla resa ottenuta con colture pure. La struttura chimica della cellulosa batterica e la presenza di acido ialuronico nei compositi cellulosa batterica e acido ialuronico sono state confermate da misure di spettroscopia infrarossa in riflettanza totale attenuata a trasformata di Fourier. Per caratterizzare la struttura superficiale dei compositi sono state effettuate analisi al microscopio elettronico a scansione. In generale, per tutti i compositi è stato osservato un aumento del diametro delle fibre. I pattern di diffrazione a raggi X dei compositi di cellulosa batterica e acido ialuronico corrispondevano al profilo della cellulosa I e in alcuni campioni è stato osservato un aumento della cristallinità. Sono stati valutati, inoltre, il contenuto di acido ialuronico nei compositi e il tasso di rilascio di acido ialuronico. Sono state stimate la capacità di trattenimento e di assorbimento dell'acqua dei compositi di cellulosa batterica e acido ialuronico. Infine, è stato eseguito un saggio di attività antimicrobica contro batteri gram-negativi e gram-positivi, impregnando i compositi con una soluzione della molecola antibatterica del timolo. I campioni hanno mostrato un significativo alone di inibizione contro i batteri gram-negativi. Il metodo di co-coltura ha permesso di ottenere un composito di cellulosa batterica e acido ialuronico con potenziali applicazioni in campo cosmetico e possibilità di ridurre i costi di produzione. Sono necessarie ulteriori analisi per testare la citotossicità del composito.
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Abstract
Microbial polymers gained tremendous attention over the decades owing to their outstanding properties and versatility. Bacterial cellulose and hyaluronic acid are two of the microbial polymers most studied and utilized. Bacterial cellulose consists of a nanofiber network with unique features such as high mechanical strength, high water-holding capacity, good biocompatibility, high purity, and high crystallinity. Bacterial cellulose produced by Komagataeibacter sucrofermentans has been classified as generally recognized as safe by the USA Food and Drug Administration. However, bacterial cellulose lacks in antibacterial, antioxidant, wound healing, and optical properties necessarily limiting its application. On the other hand, even though the high degradability, hyaluronic acid is an attractive biomaterial due to its moisturizing retention ability, viscoelasticity, lack of immunogenicity and toxicity. In addition, hyaluronic acid exhibits beneficial effects on cell growth, proliferation, and wound healing, playing a crucial role in living organisms. To overcome both material limitations, researchers have combined bacterial cellulose and hyaluronic acid through ex-situ strategies, such as soaking bacterial cellulose in hyaluronic acid-water solution. Hybrid membranes showed great potential as scaffolds for tissue regeneration. Both bacterial cellulose and hyaluronic acid production is achievable by microbial fermentation. In this frame, a strategy denoted as “microbial co-culture” could be exploited to embed hyaluronic acid into bacterial cellulose.
This thesis aims at producing a bacterial cellulose-hyaluronic acid composite through a microbial co-culture strategy. First, a pool of 17 acetic acid bacteria and 23 lactic acid bacteria strains were screened to select two high-producing strains of bacterial cellulose and two high-producing strains of hyaluronic acid, respectively. Bacterial strains used in this study were obtained from two different culture collections: Unimore Microbial Culture Collection and Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen collection. After the screening phase, selected strains were co-cultured through 4 different combinations of pairs of acetic acid and lactic acid bacteria. Higher yield of bacterial cellulose was observed after 72 hours of incubation of each acetic acid bacteria-lactic acid bacteria combination compared to yields obtained with pure-cultures. The chemical structure of bacterial cellulose and the presence of hyaluronic acid in bacterial cellulose-hyaluronic acid composites were confirmed by attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy measurements. Scanning electron microscopy analyses were carried out to characterize the surface structure of the composites. Generally, an increase in fiber diameter was observed for all the composites. X-ray diffraction patterns of bacterial cellulose-hyaluronic acid composites corresponded to cellulose I profile and an increase in crystallinity was observed in some of the samples. Hyaluronic acid content in the composites and hyaluronic acid release ratio were evaluated. Water holding capacity and water uptake of bacterial cellulose-hyaluronic acid composites were estimated. Finally, antimicrobial activity assay of a selected bacterial cellulose-hyaluronic acid composite against gram-negative and gram-positive bacteria was performed by impregnating the composites with a solution of the antibacterial molecule of thymol. Samples exhibited a larger zone of inhibition against gram-negative bacteria. Concluding, the co-culture strategy permitted to obtain a bacterial cellulose-hyaluronic acid composite, which could have outstanding potential in cosmetic field and could make the process less expensive than adding extra hyaluronic acid during bacterial cellulose production. Further analyses are needed to test the cytotoxicity of the composite and antiaging activity on skin.
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