Riassunto analitico
Il cancro ovarico è il tumore maligno più diffuso nelle donne, dopo il tumore al seno, nonché quello più letale tra i tumori ginecologici. La diagnosi avviene spesso ad uno stato avanzato per la bassa specificità della sintomatologia e per la mancanza di specifici e sensibili marcatori preventivi di malattia. Presso l’Unità di Endocrinologia del Dipartimento di Scienze Biomediche, Metaboliche e Neuroscienze dell’Università di Modena e Reggio Emilia sono stati condotti studi preliminari per identificare possibili markers tumorali associati a fattori legati alla riproduzione, in quanto si suppone che anche l’esposizione ad elevati livelli ormonali possa essere predisponente all’insorgenza di cancro ovarico. Mediante approccio in silico, è stato identificato un network di geni associati alle vie di regolazione dello sviluppo del follicolo ovarico. I dati relativi ai livelli di espressione sono stati recuperati da due dataset dalla banca dati GEO del National Center for Biotechnology Information (NCBI), confrontando un gruppo di pazienti con tumore ovarico sieroso ad alto grado e un gruppo di pazienti sane; tra questi sono stati selezionati i sette geni che avevano una maggiore differenza di espressione tra il gruppo di controllo e le pazienti oncologiche.
Lo scopo di questo progetto di tesi è confermare i dati ottenuti dalle analisi in silico, attraverso esperimenti ex vivo che valutano i livelli di espressione dei geni CCNA2, GNAQ, PRKAR1A, GPM6B, FGFR1, GNAS, ERBB2 in tessuti tumorali e di controllo, ed esperimenti in vitro eseguiti in linee cellulari tumorali ovariche per determinare i meccanismi molecolari coinvolti nella disregolazione dell’espressione di tali geni.
L’analisi ex vivo è stata condotta in retrospettivo su campioni di RNA estratti da tessuti con tumore ovarico sieroso ad alto grado e da relativi controlli di tessuto sano, analizzati mediante digital droplet PCR (ddPCR), per valutare la differenza di espressione dei geni in studio. L’analisi in vitro è stata eseguita nelle linee cellulari di tumore ovarico CAOV3 e A2780, al fine di valutare i livelli di espressione dei sette geni selezionati mediante real-time PCR (RT-PCR). Nelle stesse linee è stata valutata l’attività proliferativa mediante saggio con bromodeoxyuridina, in condizioni di over-espressione delle proteine Gαs e Gαq, in seguito a trasfezione cellulare. Le linee cellulari ovariche hGrC1, hGL5 e KGN sono state utilizzate come controllo.
La temperatura di annealing dei primers dei sette geni target e del gene housekeeping RPS7 è stata validata sulla linea cellulare CAOV3 mediante RT-PCR, ddPCR e successiva elettroforesi su gel di agarosio, dimostrando essere ottimale la temperatura di 60°C. Dall’analisi mediante RT-PCR è emerso che tutte le linee cellulari analizzate esprimono i geni CCNA2, GNAQ, PRKAR1A, GPM6B, FGFR1, GNAS, ERBB2, e che la loro espressione varia nelle diverse linee cellulari. Inoltre, dal saggio di proliferazione eseguito sulle linee over-esprimenti le proteine G è emerso come le variazioni nell’espressione della proteina Gαq e Gαs modificano l’attività proliferativa basale delle linee cellulari, sebbene non sia stata individuata una differenza significativa.
In conclusione, le linee cellulari di tumore ovarico CAOV3 e A2780 presentano una diversa espressione dei geni analizzati rispetto alle linee di controllo, e i dati ottenuti dagli esperimenti in vitro dimostrano che l’over-espressione di alcuni di questi geni può modulare la capacità proliferativa cellulare.
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