Riassunto analitico
L' osteoartrite (OA) del ginocchio è una patologia cronica, infiammatoria, caratterizzata principalmente da dolore, gonfiore e rigidità delle articolazioni colpite. È una malattia largamente diffusa in tutto il mondo, responsabile di elevati livelli di ospedalizzazione in numerosi Paesi ad alto reddito ed esercitante un impatto notevole sui costi nazionali di pubblica sanità e soprattutto comportando drammatici cambiamenti nelle vite dei pazienti. Ad oggi, non esiste cura disponibile per l' OA: alle persone affette possono essere offerti solo trattamenti chirurgici o farmacologici per la riduzione del dolore. Attualmente, numerosi trattamenti, su base cellulare e non, sono in via di sviluppo, con la speranza di fornire nuove prospettive nella risoluzione di questa patologia. Tra le nuove ricerche, le terapie cellulari che sfruttano cellule stromali mesenchimali (MSC) sembrano essere le più promettenti. Le MSC sono capaci di esibire funzioni immunomodulatorie ed antinfiammatorie quando opportunamente stimolate attraverso un processo chiamato licensing. Le MSC possono secernere costitutivamente fattori immunomodulatori a livelli basali, ma il loro priming con fattori pro-infiammatori potenzia la loro funzione terapeutica. Le MSC eseguono le loro proprietà immunomodulatorie ed antinfiammatorie grazie alla secrezione di numerose proteine, come TGF-β, HGF, IDO1, IL-6, IL-10, PGE2 (PTGS-2) and TSG-6. Nel presente lavoro di tesi, cinque fattori osteoartrite associati (IFN-γ, IL-6, MCP-1, S100A8/A9 e BRINP3) sono stati indagati come fattori di licensing per le MSC. L'impatto di ciascuna di queste molecole sulla proliferazione cellulare, la morfologia, la vitalità e le loro capacità immunosoppressive è stato valutato attraverso diversi esperimenti di read-out, comprensivi di analisi citologiche e molecolari, quali conte cellulari, osservazioni al microscopio, IDO assay e qRT-PCR. I risultati sperimentali indicano che nessuno dei fattori testati è stato in grado di influire negativamente sulla vitalità e la morfologia delle MSC. Ciascun fattore ha dimostrato di influire diversamente sulla loro proliferazione e capacità di attivare l'espressione di geni antiinfiammatori. In particolare, i risultati identificano IFN-γ (utilizzato alla concentrazione di 100 ng/ml) come il fattore con il miglior potenziale di induzione delle proprietà terapeutiche delle MSC. Inoltre, da essi si evince anche che MCP-1 e BRINP3, due fattori di licensing scarsamente indagati prima di questo lavoro per le loro abilità di priming, hanno determinato una stimolazione dell'espressione di PTGS-2. Questo progetto di tesi ha lo scopo di contribuire all'esplorazione degli effetti di licensing di mediatori osteoartrite-associati su MSC umane, derivate da midollo osseo. L'obiettivo finale sarebbe, in futuro, riuscire ad identificare la più efficace combinazione di fattori di stimolazione per attivare le MSC e così massimizzare il loro potenziale terapeutico. Questo lavoro sottolinea la criticità dell'influenza dell'ambiente infiammatorio, a cui le MSC sono esposte, nel determinare cambiamenti nel loro metabolismo. Una più profonda conoscenza della composizione dell'ambiente infiammatorio a cui le MSC sono esposte in vivo è essenziale per sviluppare una strategia di licensing patologia-specifica con un grande potenziale nell’influire efficacemente sulla progressione dell' osteoartrite. Guardando alle future prospettive, la traslazione clinica di queste tecniche di stimolazione in vitro consentirà di eseguire un priming appropriato delle MSC, prima che esse vengano inoculate localmente in vivo nelle articolazioni del ginocchio di pazienti affetti da OA.
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Abstract
Knee osteoarthritis (OA) is a chronic, inflammatory disease, mainly characterized by pain, swelling and stiffness of the injured joints. It is a worldwide pathology, causing massive hospitalization rates in many high-income countries with a strong impact on nationals’ health care costs and dramatic changes in patients’ lives. Currently, no cure is available for OA: only pain-relief treatments and surgical interventions can be offered to the affected patients. Many cellular and non-cellular treatments are currently under investigation to give new perspectives and hopes to the resolution of the pathology and at the present time cellular based therapies, in particular ones involving the use of mesenchymal stromal cells (MSCs), seem to be the most promising. MSCs are cells capable to exert immunomodulatory and anti-inflammatory capacities when opportunely stimulated through a process called licensing. MSCs can constitutively secrete immunomodulatory factors at low levels, but their priming with pro-inflammatory signals results in an empowerment of their therapeutic function. MSCs exert their immunomodulatory and anti-inflammatory properties by the active secretion of cytokines and growth factors such as TGF-β, HGF, IDO1, IL-6, IL-10, PGE2 (PTGS-2) and TSG-6. Here five OA related factors (IFN-γ, IL-6, MCP-1, S100A8/A9 and BRINP3) where explored as priming molecules for MSCs. Their impact on cell proliferation, morphology, viability and immunosuppressive capacity has been evaluated through multiple read-out assays, comprehensive of cytologic and molecular analysis involving cell counting, microscope observations, IDO assay, qRT-PCR. These results pinpoint that none of the tested factors determined impairments in MSCs vitality and morphology. Each molecule showed different effects on MSCs doubling capacity and secretion of anti-inflammatory proteins. Outcomes identified that IFN-γ at the concentration of 100 ng/ml was the factor with the best potential to induce therapeutic properties in MSCs. Interesting results have also been obtained for MCP-1 and BRINP3, two novel licensing factors, barely investigated before for their priming abilities, that here were able to stimulate the expression of PTGS-2. The present thesis has the aim to contribute at the exploration of OA related molecules licensing effects on hBM-MSCs. The final goal in future should be the identification of the best inflammatory cocktail to activate MSCs and maximize their medical properties. These project results emphasize how much the inflammatory environment in which MSCs are exposed is critical in the determination of changes in their metabolism. A deep knowledge of the inflammatory milieu composition at which MSCs are exposed in vivo is essential to develop a disease-specific licensing strategy with great potential in addressing the development of OA. Looking at future perspective, the translation of this stimulatory condition in vitro will allow us to execute a proper priming of MSCs prior their local injection into patient affected knee joints.
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