Riassunto analitico
In letteratura è sempre più riconosciuta l'importanza dei lieviti non convenzionali, alternativi al microrganismo modello Saccharomyces cerevisiae, come nuove “cell factories” per applicazioni alimentari e biotecnologiche. Di conseguenza, diversi alimenti fermentati mediante starter naturali sono stati sfruttati come bio-riserve di lieviti wild-type con maggiore resistenza verso stress multipli e un range di zuccheri fermentati più ampio rispetto a S. cerevisiae. Nel presente studio abbiamo indagato il potenziale biotecnologico di 28 ceppi di lieviti isolati dal siero innesto utilizzato per indurre l’acidificazione lattica del latte durante la produzione del formaggio Parmigiano Reggiano (PR). In particolare, abbiamo considerato 24 ceppi di Kluyveromyces marxianus, 3 ceppi di Candida pararugosa e 1 ceppo di Torulaspora delbrueckii. Tutti i ceppi sono stati valutati per la loro capacità di effettuare la fermentazione alcolica nel siero di latte, un sottoprodotto della catena di produzione del PR. I parametri cinetici di crescita sono stati valutati mediante il software Grofit e confrontati per identificare tra i ceppi i candidati più efficienti per la produzione di etanolo dal siero di latte. Inoltre è stata testata la capacita idrolitica dei lieviti nei confronti delle proteine del siero di latte e, in caso di valore positivo di attività proteolitica, le frazioni peptidiche del siero fermentato sono state caratterizzate per il loro contenuto in peptidi bioattivi attraverso analisi UHPLC MS/MS. I ceppi di Kluyveromyces marxianus sono stati inoltre testati per la loro capacità di rilasciare peptidi bioattivi anche dal latte. L’analisi di genotyping del locus MAT (mating-type) è stata eseguita per stabilire l'identità dei ceppi di K. marxianus come cellule MATa, MATalpha o MATa/MATalpha. Considerando l’importanza della capacità di fermentare zuccheri ad alta temperatura nella produzione di bioetanolo, i ceppi sono stati inoltre testati per la loro capacità di crescita a 28, 37, 42 e 48°C. Il saggio ha permesso l'identificazione di 8 candidati K. marxianus capaci di crescere fino a 48 °C. Infine, i ceppi di K. marxianus sono stati valutati per la capacità di produrre biofilm mediante screening di “mat formation” su soft agar. Questa caratteristica è rilevante a livello industriale in quanto influisce positivamente sulla crescita in matrici casearie, migliorando la qualità del prodotto finale. Nel complesso, questi risultati hanno evidenziato come i lieviti contaminanti il siero innesto del formaggio PR possono rivestire un ruolo promettente come candidati per la valorizzazione fermentativa dei siero di latte, sia come produttori di bioetanolo sia come agenti rilascianti peptidi bioattivi. Nel caso dei ceppi di K. marxianus, lo studio ha permesso di identificare candidati aploidi termotolleranti con identità cellullare MATa e MATalpha per il futuro sfruttamento in piani di miglioramento genico.
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Abstract
In literature it is increasingly recognized the importance of non-conventional yeasts, alternative to the well-known model organism Saccharomyces cerevisiae, as emerging cell factories for food and biotechnology applications. Consequently, different naturally fermented foods have been exploited as bio-reservoirs of wild yeasts with higher resistance towards multiple stressors and a wider range of sugar utilization compared with S. cerevisiae. In the present study, we investigated the biotechnological potential of 28 yeast strains isolated from natural whey starter for the Parmigiano Reggiano cheese production. In particular, we considered 24 strains of Kluyveromyces marxianus, 3 strains of Candida pararugosa and 1 strain of Torulaspora delbrueckii. All strains were evaluated for their ability to carry out alcoholic fermentation in whey, a byproduct of cheesemaking production chain. Kinetics growth parameters were evaluated by Grofit package in R and compared among strains to identify the most performing candidates for ethanol production from whey. Hydrolytic activities toward whey proteins were also evaluated and, in case of positive scoring of proteolytic activity, peptidic fractions were characterized for their content in bioactive peptides through UHPLC MS/MS analysis. Kluyveromyces marxianus strains were also tested for their ability to release bioactive peptides in milk. Genotyping of mating type regions were performed to establish the K. marxianus strains identity as MATa, MATalpha or MATa/MATalpha cells. The ability to survive at high temperature was considered as critical industrial phenotype in bioethanol production. Therefore, drop assays were carried out in YPDA medium at 28°C, 37°C, 42°C and 48°C and allowed for the identification of 8 K. marxianus candidates suitable to growth at 48°C. Finally, K. marxianus strains were also tested for the ability to make biofilm by mat formation assay on soft agar. This trait is industrially relevant in dairy products as it positively affects the growth in milk-related matrices and improve of the final product quality. Overall, these results highlighted how, beyond their role as spoilage agents, yeasts from Parmigiano Reggiano natural whey starter can be promising candidates for different industrial applications, such as fermentative valorization of whey by-product. In the case of K. marxianus strains, we identified MATa and MATalpha haploid candidates for future exploitation in breeding program.
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