Riassunto analitico
INTRODUZIONE La combinazione degli appropriati elementi cellulari con materiali idonei rappresenta un elemento cardine per lo sviluppo di metodi finalizzati alla rigenerazione tissutale. Il presente studio si è focalizzato sull’allestimento di una nuova tecnologia per la cattura selettiva di cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo (CSM-TA) e successiva colonizzazione su supporti 3D. Sono stati impiegati due materiali, il tipo A funzionalizzato mediante immobilizzazione di anticorpo anti-CD10 per la cattura selettiva delle CSM-TA, ed un biomateriale di tipo B idoneo per l’espansione delle cellule selezionate. MATERIALI E METODI Lo studio ha previsto una fase iniziale di arruolamento di un numero adeguato di CSM-TA isolate e caratterizzate mediante adesione alla plastica, analisi dell’immunofenotipo per gli antigeni CD105, CD90, CD73, CD10, CD45, CD14, HLA-DR e saggi di differenziamento verso adipe, osso e cartilagine in accordo con i noti criteri riportati in letteratura. Successivamente i campioni di CSM-TA sono stati utilizzati per verificare la performance del materiale di tipo A. Colorazioni di immunofluorescenza e indagini microscopiche avanzate hanno consentito di valutare e quantificare le CSM-TA trattenute dal materiale funzionalizzato con Ig anti-CD10. Si è quindi proceduto con il distacco delle CSM-TA e successiva semina su materiale B. Due diversi metodi di semina sono stati testati: 1) STATICO, ossia la semina di CSM-TA direttamente sulla superficie del materiale utilizzando due diverse densità 15.000 e 30.000 CSM-TA/3D B; 2) DINAMICO mediante l’utilizzo di un circuito filtrante chiuso. Per entrambe le metodiche di semina, i campioni sono stati posti in coltura per 7, 14 e 21 giorni. Al termine di ciascun time-point è stato valutato il grado di colonizzazione del biomateriale mediante colorazione con cristal violetto e indagini avanzate di microscopia ottica utilizzando lo stereomicroscopio. Il livello di colonizzazione di CSM-TA, e valutazioni morfologiche sono state ulteriormente valutate mediante colorazione con ematossilina e eosina in seguito a inclusione in paraffina. Sulle sezioni è stata eseguita l’indagine di immunoistochimica per valutare l’espressione del CD10. RISULTATI Abbiamo isolato cellule aventi morfologia fibroblastoide da 4 campioni di TA, con un elevato tasso proliferativo come mostra il Cumulative Population Doubling pari a 7,74±0,13 dopo 5 passaggi in coltura. Le cellule così amplificate riportano un’espressione >90% per il CD90, CD105, CD73 e CD10 e <10% per HLA-DR, CD14, CD45, mostrando un immunofenotipo riconducibile a quello delle CSM-TA riportato in letteratura. I saggi di differenziamento in senso adipogenico, osteogenico e condrogenico sono risultati positivi come si evince rispettivamente dalle colorazioni di Oil Red O, Alizarin Red e Safranina O, confermando ulteriormente la staminalità delle cellule isolate. In seguito al contatto delle CSM-TA con il materiale A, sono state immobilizzate un numero di cellule 2 volte superiore rispetto al materiale controllo non funzionalizzato. Il distacco dal materiale di tipo A ha dato un’efficienza >70%. La semina in statico sul materiale di tipo B ha mostrato una maggiore colonizzazione dopo 14 giorni alla densità di 15.000 CSM-TA/3D, mentre in dinamico a entrambe le densità di semina si è ottenuta una colonizzazione minore rispetto alla modalità in statico. Durante la coltura in 3D, il CD10, valutato in immunoistochimica, ha mostrato un’espressione positiva, confermando che le CSM-TA hanno preservato la loro staminalità. CONCLUSIONE Il materiale di tipo A permette la selezione di CSM-TA, il materiale B permette l’espansione delle CSM-TA suggerendo che questi possono essere alla base di nuove tecnologie per la rigenerazione tissutale.
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