Riassunto analitico
Il lavoro di ricerca di questo progetto è stato finalizzato allo sviluppo e alla validazione di nuovi ceppi probiotici e allo studio di approcci tecnici aventi lo scopo di conservare la vitalità dei probiotici stessi e di estenderne la shelf -life. E’ stata studiata l'influenza di alcune molecole crioprotettive nel processo di liofilizzazione di Lactobacillus acidophilus , un ceppo molto sensibile al congelamento. In particolare, si è valutato l'effetto protettivo di trealosio, saccarosio e maltodestrine con e senza addizione di glicerolo, nel processo liofilizzazione di L. acidophilus e sono stati messi a confronto due cicli di liofilizzazione con parametri differenti per ottimizzare le rese di processo e gli aspetti economici correlati. I risultati di questo lavoro hanno dimostrato che trealosio e saccarosio sono efficaci ai fini della conservazione della vitalità di L. acidophilus in fase di liofilizzazione. Maltodestrina consente un aumento della temperatura del prodotto durante la fase di essiccazione primaria , riducendo significativamente la durata del ciclo e la quantità di energia trasferita . E’ stato messo a punto un nuovo metodo biologico per la valutazione della biodisponibilità dei metalli zinco e selenio, internalizzati da ceppi probiotici, nella prospettiva di utilizzare tali ceppi come fonte dei metalli in forma organica. Al fine di superare le difficoltà degli esperimenti in vivo su animali, è stato sviluppato un modello di coltura cellulare per confrontare la biodisponibilità delle varie forme commerciali di selenio e zinco rispetto alle forme organiche internalizzate da Lactobacillus buchneri Lb26 DSM 16341 e Bifidobacterium lactis Bb1 DSM 17850. La coltura cellulare selezionata è stata la Caco-2, adenocarcinoma del colon umano, linea cellulare che mima l'epitelio intestinale ed è già utilizzata per studiare il trasporto di molti nutrienti. Gli studi di uptake sono stati eseguiti con sistemi filtranti permeabili (Transwell). Il dosaggio di Se e Zn nelle cellule batteriche è stato ottenuto con spettrofotometria ad assorbimento atomico (AAS). I dati sperimentali hanno indicato una significativa maggiore biodisponibilità di selenio e zinco internalizzati dai probiotici, rispetto alle altre forme inorganiche e organiche valutate. La potenziale applicazione terapeutica di Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp. nel ridurre iperossaluria attraverso l'attività intestinale di degradazione dell’ossalato è avvincente e i primi risultati sono molto promettenti. E’ stata valutata la capacità di degradare l’ossalato in vitro da una serie di probiotici usando HPLC a fase inversa. I ceppi del genere Lactobacillus testati si sono dimostrati più attivi nel degradare l’ossalato; i migliori convertitori appartengono alle specie L.paracasei , L.gasseri e L.acidophilus. I ceppi Bifidobacterium hanno dimostrato attività inferiore, probabilmente a causa della tossicità intrinseca dell’ ossalato verso questo genere.
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Abstract
The research of this Ph.D. project was aimed to the development and validation of new probiotic strains and to the study of technical approaches focused on the maintenance of the viability of the probiotics in order to extend their shelf-life. The influence of a variety of cryoprotectant media on the freeze drying process of Lactobacillus acidophilus, a strain quite sensitive to freezing,was investigated. Specifically, the objective was to evaluate the protective effect of trehalose, sucrose, and maltodextrin with or without glycerol in the freeze-drying step of L. acidophilus strain, and to compare two freeze-drying cycles in order to select the most efficient in terms of strain viability and economical aspects of the process. The results of this work showed that both trehalose and sucrose enhanced the retention of viability of L. acidophilus in freeze-drying step. Maltodextrin allowed an increase in the product temperature during the primary drying stage, decreasing significantly the duration of the cycle and the amount of energy transferred. In the perspective to develop probiotic strains able to vehicle Selenium and Zinc as organic bioavailable forms, a new biological method to evaluate minerals in Selenium/Zinc-enriched probiotics was developed. In order to overcome difficulties of in vivo animal experiments, the main purpose of this work was to develop a cell culture model to investigate the bioavailability of commercial forms of Selenium and Zinc compared to organic forms internalized by Lactobacillus buchneri Lb26 DSM 16341 and Bifidobacterium lactis Bb1 DSM 17850, respectively. As cell culture was chosen the human colon adenocarcinoma (Caco-2) cell line, that mimics the intestinal epithelium and is widely used to study the transport of many nutrients. The uptake studies were performed by polycarbonate permeable filter supports (Transwell). To investigate the rate of internalization of Se and Zn in the bacterial cells, Atomic Absorption Spectrophotometry (AAS) was used. Results indicated that selenium uptake of Se-enriched L. buchneri Lb26 and Zn-enriched B. lactis Bb1 are higher than Se and Zn organic and inorganic forms. The potential therapeutic application of Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. in reducing hyperoxaluria in vivo through intestinal oxalate degrading activity is compelling and the first reports are very promising. The capacity to degrade oxalate in vitro by a large number of probiotics was explored, using reverse-phase HPLC. Lactobacillus strains were more efficient than bifidobacteriainoxalate degradation. Among Lactobacillus spp., the best converters belong to Lactobacillus paracasei, L.gasseri, and L.acidophilus strains.Bifidobacterium strains performed worse probably due to intrinsic oxalate toxicity toward this genus.
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