Riassunto analitico
La Leishmaniosi è una malattia che colpisce milioni di persone in tutto il mondo, specialmente nelle aree tropicali e subtropicali, causando mortalità e morbidità. Secondo la World Health Organization (WHO) il patogeno è endemico in 88 paesi e la rilevanza della malattia è stimata di 12 milioni di persone infette e 350 milioni di persone a rischio. L'agente eziologico è la Leishmania, un parassita protozoo appartenente alla famiglia dei Tripanosomatidi nell'ordine dei Kinetoplastidi. Circa 20 specie e sottospecie diverse di Leishmania sono state descritte e la loro eterogeneità si riflette in un ampio spettro di manifestazioni cliniche. Le leishmaniosi può essere classificata come: cutanea, viscerale, muco-cutanea e post-kala azar. La trasmissione della leishmaniosi è attribuita ad insetti della specie Lutzomya e Phlebotomus. L'insetto acquisisce il parassita da un mammifero infetto e durante il successivo pasto di sangue il parassita è inoculato nell'ospite umano o animale. Al giorno d'oggi non esistono vaccini disponibili per la prevenzione, perciò il trattamento attuale è basato esclusivamente sull'utilizzo di chemioterapici: antimoniali pentavalenti,amfotericina B e la formulazione lipidica, miltefosine e paromomicina.Il loro utilizzo tuttavia è limitato dalla loro tossicità, gli elevati costi, la difficoltà di somministraione e dall'insorgenza di resistenza. quindi è di notevole importanza lo sviluppo di nuovi farmaci e la scoperta di nuovi target farmaceutici per la cura delle leishmaniosi. Il pathway dei folati è attualmente un target per il trattamento di malattie batteriche, tumori e alcune malattie parassitarie, tra cui la malaria; ed è considerato un potenziale target per la cura delle leishmaniosi. Data la loro importanza nel pathway dei folati gli enzimi Timidilato Sintasi (TS) e Diidrofolato reduttasi (DHFR)sono importanti target. Sebbene i Tripanosomatidi siano auxotrofici per i folati e le pterine, gli antifolati non sono attualmente impiegati nella terapia di infezioni da tripanosomatidi, soprattutto a causa della PTR1. L'enzima PTR1 è una deidrogenasi/reduttasi a catena corta che può ridurre sia i folati che le pterine nello stesso modo in cui agisce la TS-DHFR, ma è meno suscettibile all'azione degli antifolati. Questo suggerisce che è necessario trovare un inibitore in grado di interagire su entrambi gli enzimi o due inibitori da poter usare in combinazione che agiscano in modo specifico sugli enzimi separatamente. In accordo a ciò, l'obiettivo della mia tesi è identificare nuovi lead e hit che possano portare allo sviluppo di nuovi farmaci anti-leishmaniosi. A tal fine sono stati utilizzai due approcci: a) medium throughput screening (MTS) di una library di composti tiadiazolici e benzotiazolici per evidenziare l'attività inibente dell'enzima PTR1; b) profilo dell'attività antiparrassitaria dei composti usati sia da soli che in combinazione con la pirimetamina, un farmaco antifolato conosciuto. Per la strategia a) è stata considerata una library di 26 composti e i test sono stati eseguiti usando un saggio cromogenico basato sulla reazione di riduzione della biopterina a diidrobiopterina e a tetraidrobiopterina usando il NADPH come cofattore; per la strategia b)sono stati eseguiti nel laboratorio della professoressa Anabela Cordeiro presso IBMC-INEB Associate Laboratory a Porto (Portogallo) sul parassita Leishmania infantum in forma promastigote per valutarne l'effetto sinergico.
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Abstract
Leishmaniasis is a major public disease that affects millions of people worldwide, especially in tropical and subtropical areas, causing morbidity and mortality. According to the World Health Organization (WHO) the pathogen is endemic in 88 countries and the magnitude of the disease is estimated of 12 million infected people and 350 million people at risk.
The causative agent of the disease is Leishmania, a protozoan parasite belonging to the Trypanosomatidae family in the Kinetoplastidae order. Almost 20 different species and subspecies of Leishmania are described and this heterogeneity is reflected in a broad spectrum of clinical manifestations. Thus Leishmaniasis is classified as: cutaneous, visceral, muco-cutaneous. Cutaneous leishmaniasis and post-kala azar dermal leishmaniasis are the most diffuse form.
The transmission of leishmaniasis is attributed to sandfly species, Lutzomya and Phlebotomus. The parasite enters the female sandflies by sucking the blood from an infected mammalian host. During a subsequent blood-meal the parasite is inoculated in the skin of human or mammalian hosts.
Till date there are no effective vaccines available, so the current treatment is based solely on chemotherapy. Pentavalent antimonials, amphotericin B and its lipid formulation, miltefosine and paromomycin are available but their use is limited due to toxicity, high cost and difficult administration. The problem is compounded by a rise in drug resistance strains. Therefore, it is of great importance to look for effective drugs and new drug targets for the treatment of leishmaniasis.
Folate pathway is a current drug target for the treatment of bacterial, cancer, and certain parasitic diseases (e.g. malaria), and it has been of interested for leishmaniasis diseases since few years; since their importance TS and DHFR, two main enzymes involved in the folates synthesis, are notable drug targets.
Even though Trypanosomatids are auxotrophic for folates and pterins, antifolates are currently not employed in therapy of trypanosomatid infections, mainly because of PTR1.
PTR1 is a short-chain dehydrogenase/reductase that can reduce both pterins and folates as DHFR-TS does but is much less susceptible to inhibition by antifolates than.
This indicates that an inhibitor is required to target both the enzymes simultaneously or that two compounds specifically inhibiting both the enzymes can be used in combination.
In according to these suggestions, the purpose of my thesis was to identify new hits and leads that could guide to the development of antileishmania drugs.
To this aim I have studied thiadiazolic and benzothiadiazolic compounds through two different approaches: a) by medium throughput library screening (MTS) of their PTR1 enzymatic activity inhibition; b) antileishmania activity profile, alone or in combination with pyrimethamine, a known antifolate drugs.
Strategy a) was applied to a 26 compounds library . The test was performed applying a chromogenic assay based on the reduction reaction of biopterin to dihydrobiopterin and tetrahydrobiopterin using NADPH as a cofactor.
Strategy b) was performed in prof. Anabela Cordeiro laboratory at the IBMC-INEB Associate Laboratory in Oporto (Portugal). A cell based screening assay on Leishmania infantum promastigotes was performed for evaluating synergistic effect with pyrimethamine.
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