Riassunto analitico
Il melanoma è una forma di cancro aggressiva e quando metastatico, generalmente fatale. E’ quindi importante comprendere i meccanismi alla base dell’insorgenza e della progressione del tumore. Uno dei principali meccanismi del melanoma è l’inattivazione dell’apoptosi, le cellule tumorali infatti aumentano la loro capacità di evolversi e incrementano la loro resistenza ai chemioterapici. È stato dimostrato nel nostro laboratorio che linee cellulari di melanoma esprimono entrambe le classi di recettori per le neurotrofine: p75NTR e i Trks. p75NTR ha un duplice ruolo poiché è in grado sia di mediare sopravvivenza, sia di mediare morte cellulare. Nonostante il melanoma sia una delle neoplasie più studiate, le tecniche colturali non hanno ancora consentito di ottenere risultati ottimali. Il metodo più utilizzato sono le colture cellulari in adesione (2D) di linee di melanoma, sia primario che metastatico anche se non permette di studiare il tumore all’interno del suo microambiente. Si è quindi cercato di realizzare modelli tridimensionali (3D), dove le cellule, fatte crescere in sospensione, solo se tumorali riescono ad aggregarsi formando sferoidi, simulando così, il loro sviluppo in vivo. Lo scopo di questo lavoro è quello di studiare l’aggressività di linee di melanoma in vitro mediante l’utilizzo di sferoidi multicellari.Abbiamo utilizzato cinque linee cellulari: le WM115 e le WM266-4, un melanoma primario e il suo metastatico “radial growth phase”, le SK-Mel28, un melanoma primario di tipo “vertical growth phase”, le WM793B e le 1205Lu, un primario e il suo metastatico di tipo “vertical growth phase”. Le cellule sono state messe in coltura in 2D e in 3D e abbiamo valutato la crescita cellulare, mediante MTT e studio del coefficiente proliferativo. Abbiamo osservato che le linee di melanoma, coltivate in 3D, presentano caratteristiche proliferative diverse a seconda del grado di progressione del tumore. Questo dato è stato confermato dalla quantificazione dell’area accupata dalle sfere. Per studiare l’invasività, gli sferoidi, a 72 ore dalla semina, sono stati messi all’interno di una matrice di collagene. Il grado di invasività è stato valutato quantificando le cellule che escono dalla sfera e si è osservata una capacità di invasione correlata con il grado di progressione del tumore. Aggiungendo il cisplatino agli sferoidi, l’MTT e il coefficiente proliferativo hanno rivelato un diverso comportamento del sistema in 2D rispetto al 3D. Inoltre, il cisplatino riduce l’invasività delle cellule di melanoma quando inserite nel collagene, suggerendo come gli sferoidi siano un buon modello per valutare l’aggressività delle cellule in vitro. Infine, abbiamo confrontato l’espressione di p75NTR mediante l’analisi al FACS nei due modelli 2D e 3D, e abbiamo osservato una sua diminuzione negli sferoidi, confermata anche dall’analisi al confocale. Questi risultati indicano che gli sferoidi assumono un fenotipo più aggressivo rispetto alle cellule in 2D, in quanto meno sensibili all’apoptosi. Abbiamo quindi separato cellule SKMel28 p75NTRbright dalle SKMel28 p75NTRdim mediante FACS. L’MTT e la quantificazione dell’area occupata dalle sfere rivela che le cellule p75NTRbright coltivate in 3D hanno una capacità di crescita inferiore rispetto alle p75NTRdim e un’aggressività inferiore all’interno del collagene. Concludendo si può affermare che mediante l’utilizzo degli sferoidi si osserva un’ aggressività delle cellule di melanoma in vitro in relazione allo stato di progressione del tumore e maggiore rispetto alle colture in 2D. Inoltre l’aggressività delle cellule di melanoma sembra essere inversamente correlata all’espressione di p75NTR.
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