Riassunto analitico
Il differenziamento muscolare viene regolato da due famiglie di fattori di trascrizione: i determinanti miogenici muscolo-specifici della famiglia bHLH ( Muscle Regulatory factors MRFs) e i fattori ubiquitari della famiglia MEF2 (Myocyte Ehnancer Factor 2) MEF2A, ME2B, MEF2C, MEF2D; i membri di queste due famiglie formano complessi multiproteici che attivano sinergicamente la trascrizione dei geni muscolo specifici.Tra i membri della famiglia MEF2, MEF2C svolge un ruolo predominante nel differenziamento muscolare e la sua funzione non è ridondante con quella degli altri membri.La sua regolazione avviene mediante la modulazione della trascrizione, splicing alternativo, livelli proteici, modificazioni post-traduzionali e interazione con co-attivatori e co-repressori.L’analisi delle modificazioni post-traduzionali è stata condotta in passato nel nostro laboratorio mediante un approccio di spettrometria di massa che ha rilevato due siti fosfo-accettori mai descritti in letteratura: Ser98 e Ser110.È stato anche dimostrato che questi due residui seguiti da una prolina, quando fosforilati sono essenziali per l’interazione fisica con Pin1, una peptidil cis/trans isomerasi che riconosce il motivo amminoacidico pSer/Thr-Pro catalizzando l’isomerizzazione cis/trans di questo legame peptidico.L’effetto di questa interazione consiste in una riduzione della stabilità e dell’attività transattivante della proteina MEF2C ed è stata osservata un’inibizione del differenziamento muscolare che suggerisce un nuovo ruolo di Pin1 come regolatore negativo della miogenesi scheletrica.Visto il coinvolgimento di questi residui nella modulazione dell’attività della proteina MEF2C abbiamo valutato se la fosforilazione di questi due residui subisce una modifica nel corso del differenziamento muscolare nella linea murina C2C7, un modello accreditato di questo processo in vitro. Grazie all’utilizzo di anticorpi fosfo-specifici, abbiamo osservato che MEF2C è fosforilato in modo selettivo in cellule proliferanti (mioblasti) e che tale fosforilazione si riduce nel corso del differenziamento a miotubi.Le cellule C2C7 sono una linea che deriva dalle cellule satelliti, cellule che nel muscolo adulto sono mitoticamente quiescenti, risiedono in una nicchia tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari ad esse associate ed esibiscono un’espressione genica e una sintesi proteica limitata ma possono attivarsi in risposta allo stress indotto da trauma, come una lesione o nel contesto di una malattia mio-degenerativa. Una volta attivate le cellule satelliti proliferano e in seguito differenziano a miotubi, una quota ritorna allo stato di quiescenza, garantendo il mantenimento di un pool di cellule staminali residenti (self-renewal). L’equilibrio tra questi processi è finemente regolato da numerose vie di segnalazione.Scopo della tesi è stato di analizzare il livello di fosforilazione di queste Serine nelle cellule satelliti durante la loro progressione miogenica allo scopo di comprenderne il significato funzionale. Tale studio è stato condotto: in vitro, su cellule satelliti in coltura primaria o nella loro nicchia in colture di fibre singole, e in vivo, in muscoli prelevati da topi a vari tempi a seguito di un danno indotto dal trattamento con cardiotossina.Da questa analisi abbiamo osservato un pattern dinamico sia nella fosforilazione dei due residui di serina che nell’espressione di specifiche isoforme di splicing durante la progressione miogenica delle cellule satelliti.In particolare è stato rilevato che MEF2C è fosforilato massivamente sulle serine 98 e 110 in fase di proliferazione e questo sia in coltura che in modelli in vivo di rigenerazione.Questi dati suggeriscono che questa fosforilazione potrebbe avere un ruolo nel promuovere la proliferezione e/o inibire il differenziamento terminale precoce delle cellule satelliti.
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