Riassunto analitico
Il siero innesto (natural whey starter, NWS) è un consorzio microbico composto principalmente da ceppi multipli di alcune specie di batteri lattici termofili e omofermentanti, ovvero Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis e Streptococcus thermophilus. Questa coltura starter indefinita guida il processo di acidificazione durante la produzione del Parmigiano Reggiano DOP e viene prodotta quotidianamente mediante una pratica di back-slopping, attraverso la fermentazione del siero dolce in condizioni di temperatura controllata dopo ogni fase di caseificazione. Nonostante l'importanza economica di NWS, pochi studi hanno indagato la biodiversità microbica con un approccio integrato di metagenomica e culturomica. Nel presente studio abbiamo raccolto 144 campioni di NWS durante 6 diversi periodi di campionamento e li abbiamo sottoposti a caratterizzazione fisico-chimica, estrazione del DNA totale e analisi WGS. Dei 144 campioni, 24 raccolti in autunno e in primavera sono stati analizzati anche mediante approccio culturomico su quattro diversi terreni di coltura, tre dei quali per enumerare ed isolare la frazione coltivabile dei batteri lattici, mentre l'altro per enumerare i lieviti contaminanti. Dai terreni di coltura per la rilevazione della frazione lattobacillare coltivabile sono state isolate 240 colture batteriche isogeniche, sottoposte a colorazione di Gram e a reazione con catalasi. Per identificare gli isolati a livello di specie sono stati eseguiti un saggio Pentaplex-PCR disegnato su tre diversi geni housekeepinng, l'analisi 16S-ARDRA con l'enzima diagnostico MseI e, su alcuni ceppi rappresentativi, il sequenziamento del gene 16S rRNA. L'analisi metagenomica ha permesso di dividere i campioni NWS in cluster H, dominato da L. helveticus, e in cluster D, dominato da L. delbrueckii e di studiare le flottazioni nel tempo del profilo compositivo di ogni NWS. L'analisi comparativa dei dati colturomici e metagenomici ha evidenziato un problema di coltivabilità per la specie di L. delbrueckii sui terreni standard per la coltivazione dei batteri lattici. Un sottoinsieme di 120 isolati attribuiti a Lactobacillus helveticus è stato genotipizzato mediante (GTG)5 REP-PCR per stimare la diversità della frazione coltivabile a livello inter-specie e dereplicare la libreria di cloni. I ceppi di L. helveticus con profili di genotipizzazione unici sono stati sottoposti a caratterizzazione fenotipica per la capacità di crescere in presenza di diversi fattori di stress, quali sali biliari e lisozima, evidenziando n elevato livello di diversità tra i ceppi analizzati.
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Abstract
Natural whey starter (NWS) is a microbial consortium mainly composed by multiple strains of a few thermophilic and homo-fermentative lactic acid bacteria species, namely, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, and Streptococcus thermophilus. This undefined starter culture drives the acidification process during the Parmigiano Reggiano PDO cheese production and is daily produced through back-slopping, by fermenting sweet whey under temperature-controlled conditions after each caseification step. Despite the economic importance of NWS, few studies investigated microbial biodiversity by an integrated metagenomics and culturomics approach. Here, we collected 144 NWS samples during 6 different sampling times and submitted them to physico-chemical characterization, total DNA extraction and WGS analysis. Out of 144 samples, 24 collected in Autumn and Spring were also analyzed by culturomics on four different media, three of them for enumerating and isolating cultivable fraction of lactic acid bacteria, while the other one for enumerating spoilage yeasts. From lactic acid bacteria media 240 bacterial isogenic cultures were isolated and submitted to Gram staining and catalase reaction. Pentaplex-PCR targeting three different housekeeping genes was implemented together with 16S-ARDRA analysis with MseI diagnostic enzyme, and 16S rRNA gene sequencing to identify the isolates at species level. Species relative abundance determined by metagenomics highlighted recursive pattern of species distribution in NWS and clustered them in type-H, enriched in L. helveticus, and type-D, enriched in L. delbrueckii. Furthermore, comparative analysis between culturomics and metagenomics data identified bias in culturing L. delbrueckii species on standard media for lactic acid bacteria cultivation. A sub-set of 120 isolates attributed to L. helveticus was genotyped by (GTG)5 REP-PCR to estimate the cultivable diversity at intra-species level and dereplicate the library of clones. L. helveticus strains with unique genotyping profiles were submitted to phenotype characterization for the ability to grow in the presence of different concentrations of bile salts and lysozyme, highlighting a huge diversity of the analyzed strains in adapting to different stressors.
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