• 3D-Model (Spheroids)
• CD271
• Neurotrophins
• Primary human cells
• SCC

Il carcinoma squamocellulare cutaneo (cSCC) rappresenta il secondo tipo più comune di cancro della pelle, la cui incidenza aumenta ogni anno in Europa e USA. Il cSCC si sviluppa a seguito di alterazioni nei cheratinociti epidermici. A partire da una lesione precancerosa, come la cheratosi attinica, può divenire un tumore potenzialmente metastatico. Recentemente, è stato dimostrato come le cellule di cSCC esprimenti alti livelli di β1-integrina, definite “rapid adhering” (RAD) cells, che in vitro aderiscono al collagene IV in 5 minuti, siano in grado di generare in vivo un tumore più aggressivo, se confrontati con i cheratinociti di cSCC “non rapid adhering” (NRAD). Nella pelle, le neurotrofine (NT) giocano un ruolo importante nel controllare la crescita e il differenziamento dell’epidermide umana. Le NT legano due tipi di recettori trans-membrana: il recettore p75 (anche chiamato CD271) e i recettori delle tropomiosine Trk (TrkA, TrkB e TrkC). Nei cheratinociti umani sani, il recettore TrkA promuove la proliferazione cellulare, mentre il recettore CD271 interagisce con molteplici co-recettori e ligandi mediando diverse funzioni, come apoptosi e differenziamento. È stato inoltre dimostrato che CD271 può mediare la transizione da cellula staminale al suo progenitore più differenziato, le cellule “Transient Amplyfing” (TA). Considerato il coinvolgimento di TrkA e CD271 nel garantire l’omeostasi dell’epidermide, l’ipotesi di partenza è che il network delle neurotrofine giochi un ruolo importante nel favorire lo sviluppo e la progressione dell’cSCC. Precedenti studi effettuati su sferoidi ottenuti a partire da cellule SCC13 mostrano come l’overespressione di CD271 promuova una diminuzione di dimensione, crescita e massa complessiva degli sferoidi, a cui si associa una parziale inibizione della via mitogenica. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di definire un modello tridimensionale (sferoide) di cSCC primario umano in vitro a partire da cellule RAD e NRAD. Gli sferoidi ottenuti sono stati utilizzati per analizzare l’espressione e la funzione delle neurotrofine e dei suoi recettori nel cSCC. A partire da biopsie cutanee ottenute in seguito a consenso informato del paziente sono state isolate le cellule primarie umane di cSCC da cui poi sono state ottenute le due rispettive sottopopolazioni cellulari, RAD e NRAD. Una parte delle cellule ottenute in seguito a digestione tissutale è stata utilizzata come cellule “Totali”. In seguito, gli sferoidi sono stati formati a partire da queste sottopopolazioni. Gli sferoidi RAD mostrano una maggior vitalità se confrontati con quelli Totali e NRAD. Inoltre, gli sferoidi RAD mostrano una considerevole abilità di invasione nella matrice di collagene di tipo I, confermata da un aumento dell’area di invasione e dalla riduzione della sfericità e del grado di compattezza dello sferoide. Allo stesso tempo, gli sferoidi mostrano un diverso pattern di espressione (mRNA) delle neurotrofine e dei loro recettori con livelli di NGFR (CD271) e di NTRK2 (TrkB) più elevati negli sferoidi NRAD, contrariamente a NTRK1 (TrkA) e NTRK3 (TrkC) che risultano più espressi negli sferoidi RAD. Inoltre, sono stati rilevati bassi livelli di NT4 ed elevati livelli di NGF e BDNF negli sferoidi NRAD, mentre non si riscontrano differenze nei livelli di espressione di NT3. Nel loro insieme, questi risultati indicano una più elevata capacità di proliferazione e invasione da parte degli sferoidi RAD rispetto agli sferoidi NRAD. Tale differenza può essere potenzialmente associata ad un’espressione opposta di CD271 e TrkA. Avvalendosi dell’uso di modelli tridimensionali, ulteriori studi su cellule primarie umane di cSCC potranno aiutare a comprendere meglio il ruolo delle neurotrofine e del network ad esse associato nello sviluppo e nella progressione del carcinoma squamocellulare.

Cutaneous Squamous Cell Carcinoma (cSCC) represents the second most frequent type of skin cancer with an increasing incidence every year in Europe and US. cSCC evolves from a precancerous lesion, actinic keratosis (AK), involving epidermal keratinocytes, and might display a higher metastatic potential. Recently, it has been demonstrated how cSCC cells expressing the highest β1-integrin levels, the rapid adhering (RAD) cells, which adhere to collagen IV within 5 minutes, are able to generate more aggressive tumours characterized by high migration capacity and hyperproliferation, as compared to non-rapid adhering (NRAD) cSCC keratinocytes. In the skin, neurotrophins (NTs) play a pivotal role in controlling growth and differentiation of human epidermis. NTs bind two types of transmembrane receptors: p75 neurotrophin receptor (also named CD271) and tropomyosin receptor Trks (TrkA, TrkB and TrkC). In normal human keratinocytes, TrkA promotes cell proliferation, while CD271 interacts with a variety of co-receptors and ligands to mediate several functions, such as apoptosis and keratinocytes differentiation. It has been also demonstrated that CD271 could mediate the transition from keratinocyte stem cells (KSC) to the progenitor, more differentiated, Transient Amplyfing (TA) cells. Given that both TrkA and CD271 are implicated in ensuring epidermal homeostasis, the working hypothesis is that NTs network has a pivotal role in cSCC development and progression. Preliminary observation indicates that CD271 overexpression in SCC13 derived spheroids promotes a decrease of the size, growth, and mass, which is also associated with a lower mitogenic pathway activity. Therefore, the aim of this research was to establish a three-dimensional (3D) model (spheroid) of primary human cSCC, starting from RAD and NRAD cells and to analyse the expression and function of NTs and their receptors in cSCC subpopulations derived spheroids. After the sign of the informed consent by patients, primary human cSCC cells were isolated from biopsy and RAD and NRAD cells subpopulation were further obtained. Bulk cSCC keratinocytes were used as "Total" cSCC populations. cSCC spheroids were subsequently set up from those populations. RAD spheroids displayed a greater viability as compared to TOTAL and non-RAD ones. Moreover, RAD spheroids showed a considerably spreading ability in collagen I matrix, confirmed by an increase in invasion area and a reduction in circularity and compactness of spheroids. At the same time, cSCC subpopulations derived spheroids exhibited a different pattern of expression of NTs and their receptors, with higher levels of NGFR (CD271) and NTRK2 (TrkB) in NRAD spheroids, while NTRK1 (TrkA) and NTRK3 (TrkC) are greater expressed in RAD spheroids. Furthermore, low levels of NT4 and a larger amount of both NGF and BDNF were revealed in NRAD spheroids, while there are no differences in NT3 expression between RAD and NRAD spheroids. All together, these data indicate a higher potential proliferative and invasive capacity of RAD spheroids compared to the NRAD ones, which could be associated to the opposite expression of CD271 and TrkA. Further research on primary human cSCC cells, by using 3D models, may help to better understand the role of NTs and NTRs network in cSCC development and progression.