Riassunto analitico
CD271, chiamato anche p75NTR (p75 Neurotrophin Receptor), è un recettore transmembrana a bassa affinità per le neurotrofine e appartiene alla superfamiglia del recettore per il fattore di necrosi tumorale (TNF). Nei cheratinociti umani, il CD271 interagisce con numerosi ligandi e co-recettori mediando diverse risposte cellulari, come apoptosi e sopravvivenza. Nella pelle, CD271 è coinvolto nel processo differenziativo e, in particolare, nella transizione da cellula staminale a cellula “Transient-Amplifyng” (TA). CD271 è implicato anche nella patogenesi cutanea. Infatti, è assente nella psoriasi, patologia caratterizzata da iperproliferazione dei cheratinociti e ridotta apoptosi, mentre il suo ruolo nel cancro sembra essere controverso. CD271 è espresso in modo eterogeneo nei carcinomi a cellule squamose della testa e del collo e orale, ma la sua funzione nel carcinoma squamocellulare cutaneo (cSCC) non è ancora chiara dal punto di vista funzionale. In particolare, CD271 è scarsamente rilevabile solo nel cSCC ben differenziato. Ad oggi, sono stati sviluppati diversi modelli animali per ottenere un completo knockout del CD271, i quali hanno mostrato alterazioni cutanee ed ulcere entro i 4 mesi dalla nascita. Si è poi compreso che veniva preservata un’isoforma funzionale del recettore. In seguito, è stato generato un modello condizionale con delezione specifica di CD271 nelle cellule della cresta neurale, per studiare il ruolo di CD271 nello sviluppo del sistema nervoso. In questo modello è stato usato il sistema Cre-loxP per generare un topo CD271 “floxato”, il quale è stato poi incrociato con un topo Wnt1-Cre per eliminare CD271 nelle cellule della cresta neurale. Il topo CD271 flox precedentemente generato si è dimostrato essere un valido strumento per lo studio del CD271 in diverse cellule o tessuti.
L’obiettivo di questo progetto di tesi è stato quello di caratterizzare dal punto di vista cutaneo un nuovo modello murino, generato introducendo una delezione epidermo-specifica di CD271 sotto il controllo del promotore della cheratina 14.
La prima generazione di animali CD271cKO (cKO) ha manifestato evidenti alterazioni a carico della cute, come iperplasia epidermica e sviluppo anomalo del compartimento dermico. La caratterizzazione fenotipica degli animali è stata eseguita a diversi momenti dello sviluppo post-natale. L’analisi della pelle dei topi cKO ha evidenziato una profonda disorganizzazione dell’epidermide rispetto ai topi wild-type (WT), dato che i cheratinociti basali perdono la tipica polarizzazione e disposizione a palizzata. Inoltre, l’epidermide è significativamente più spessa, mentre il derma presenta un numero più elevato di follicoli piliferi rispetto agli animali WT. I cheratinociti primari murini (PMK) provenienti da topi neonati cKO hanno mostrato un tasso proliferativo maggiore rispetto ai PMK WT, con una up-regolazione dell’espressione della Cheratina 6; inoltre, queste cellule sembrano essere più resistenti agli stimoli differenziativi indotti dal calcio. Per analizzare il coinvolgimento di CD271 nelle patologie cutanee caratterizzate da iperproliferazione e infiammazione, è stato eseguito un trattamento acuto con tetradecanoilforbolo acetato (TPA). Gli animali cKO trattati mostrano un aumento dello spessore dell’epidermide, un incremento ancora più elevato dei follicoli piliferi e alterazioni nella composizione della matrice extracellulare. Inoltre, l’espressione di marker di differenziamento dell’epidermide, come la Cheratina 1, è risultata essere deregolata nell’epidermide dei topi cKO trattati con TPA. Di conseguenza, questi dati suggeriscono che il CD271 sia un regolatore chiave del differenziamento e dell’organizzazione della pelle; per questo motivo, questo modello si pone come uno strumento essenziale per lo studio del network delle neurotrofine nello sviluppo di numerosi processi patologici.
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Abstract
CD271, also called p75NTR, is a transmembrane low-affinity receptor for neurotrophins, belonging to the tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily. In human keratinocytes, CD271 is able to interact with various ligands and partners to form multimeric complexes mediating different cellular responses, including both apoptosis and cell survival. In the skin, CD271 is involved in the differentiation process, and, in particular, in the transition from keratinocyte stem cells (KSC) to transient-amplifying cells (TA). CD271 is also implicated in cutaneous pathogenesis. Indeed, it is absent in psoriasis, a skin pathology characterized by keratinocytes hyperproliferation and reduced apoptosis. On the other hand, its role in cancer seems to be controversial. CD271 is heterogeneously expressed in head and neck and oral squamous cell carcinoma, while its function in cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) remains functionally unclear. In particular, CD271 is scarcely detectable in well differentiated cSCC as compared to normal epidermal keratinocytes.
Nowadays, different animal models have been developed to obtain CD271 full knockout. These mice showed skin alterations and ulcers by 4 months of age and it was later understood that an isoform of the receptor was preserved. Later, a conditional neural crest-specific CD271 knockout model was generated to investigate the role of CD271 in the nervous system development: animals displayed a peripheral neuropathy and abnormal hind limb reflexes. In this model, the Cre-loxP system was used to generate a CD271 floxed mouse, which was further crossed with a Wnt1-Cre to conditionally delete CD271 in neural crest cells. Interestingly, the CD271 floxed mouse has been displayed a potential tool to study CD271 in different cells or tissues.
For this reason, the aim of this research project was to characterize a novel murine model, generated by introducing an epidermal-specific deletion of CD271, by the use of the Cre-loxP system. In particular, Cre expression was under the control of the Keratin 14 promoter.
First generation of CD271cKO mice displayed skin abnormalities, such as epidermal hyperplasia and alteration of the dermal compartment.
The phenotypical characterization of the CD271cKO (cKO) animals was conducted at different steps of postnatal development. The analysis of the cKO vs wild-type (WT) skin highlighted a profound epidermis disorganization, as basal keratinocytes lose their typical palisade disposition and polarization. Moreover, epidermis appears to be significantly thicker as compared to WT, while dermis shows a higher amount of hair follicles than WT mice. Primary mouse keratinocytes (PMK) from neonatal cKO mice showed a higher proliferation rate than WT PMK, showing an upregulation of Keratin 6 expression. Furthermore, they seem to be more resistant to calcium-induced differentiation stimuli.
To analyze the involvement of CD271 into skin pathologies characterized by hyperproliferation and inflammation, acute treatment with
tetradecanoylphorbol acetate (TPA) was performed. Treated cKO animals present an increase in the epidermal thickness and, even more, in the amount of hair follicles, as well as alterations of extracellular matrix composition. Moreover, the expression of the epidermal differentiation marker, such as Keratin 1, was deregulated in TPA treated KO epidermis.
These data strongly suggest that CD271 is a key regulator of differentiation and skin organization. Therefore, this model will be an essential tool for the study of the NT network in the development of various pathological processes.
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