Riassunto analitico
NF-Y è un fattore di trascrizione eterotrimerico, costituito dalle subunità NF-YA, NF-YB e NF-YC, in grado di legare la sequenza specifica CCAAT, presente nei promotori di molti geni eucariotici coinvolti nella progressione del ciclo cellulare e nella proliferazione. La subunità NF-YA, direttamente coinvolta nel legame al DNA, presenta due forme di splicing alternativo: NF-YAs, principalmente associata al processo di proliferazione e la cui espressione è essenziale per il mantenimento della staminalità, e NF-YAl, maggiormente coinvolta nei processi di differenziamento cellulare.
Nel tessuto muscolare scheletrico differenziato, NF-YA risulta down-regolata ma è altamente espressa nelle cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) e durante il processo di rigenerazione muscolare, condizione indotta a seguito di traumi muscolari o patologie muscolari degenerative. Diversamente dagli altri contesti staminali fino ad ora studiati che mostrano la sola espressione di NF-YAs, le cellule satelliti esprimono esclusivamente NF-YAl.
Con l’obiettivo di indagare il ruolo di NF-YA nei processi di proliferazione e differenziamento nella cellula satellite del muscolo, è stato impiegato un modello murino knock-out condizionale (NF-YA-cKO) Pax7/CreERt2; NF-YA flox/flox, generato mediante l’impiego della tecnologia Cre-LoxP che consente di ottenere la delezione specifica della subunità NF-YA nelle cellule satelliti.
Mediante esperimenti ex vivo su cellule satelliti isolate dal muscolo scheletrico del modello murino NF-YA-cKO è stato possibile caratterizzare a livello trascrizionale l’effetto della delezione di NF-YA. A tale scopo sono state condotte analisi di RNA Sequencing che hanno mostrato una indotta espressione dei geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare e una down-regolazione dei geni coinvolti nel processo miogenico e nel blocco del ciclo cellulare (inibitori dei complessi ciclina/cdk), nelle cellule del topo cKO rispetto al WT.
L’espressione dei principali geni differenzialmente espressi nelle cellule cKO rispetto alle WT è stata successivamente confermata mediante analisi RT-qPCR. Esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) hanno dimostrato un ridotto binding di NF-YA ai geni target di NF-Y che regolano il ciclo cellulare. L’analisi del ciclo cellulare ha evidenziato un accumulo delle cellule cKO nella fase G2/M rispetto alle cellule WT, a sostegno dei dati molecolari emersi.
Allo scopo di caratterizzare meglio a livello cellulare e molecolare i meccanismi alla base dell’effetto trascrizionale in seguito alla delezione di NF-YA, è stato riprodotto il modello KO in vitro sfruttando la tecnologia Cre-LoxP. Cellule satelliti isolate da topo con genotipo NF-YAflox/flox e WT sono state infettate con adenovirus ricombinanti esprimenti l’enzima Cre-ricombinasi. Analisi RT-qPCR hanno permesso di validare il sistema cellulare e di ottenere un nuovo modello di studio KO in vitro. Il profilo trascrizionale nelle cellule satelliti KO in vitro si è rivelato simile a quello osservato nel modello ex vivo.
L’analisi dei risultati emersi nei modelli ex vivo e in vitro suggeriscono che, nelle cellule staminali muscolari, NF-YA potrebbe ricoprire un ruolo diverso da quello comunemente osservato in altri contesti staminali. In particolare, la presenza esclusiva di NF-YAl potrebbe indicare un ruolo atipico svolto dal fattore di trascrizione nelle cellule staminali muscolari.
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