Riassunto analitico
I microRNA (miRNA) possiedono un ruolo chiave nella regolazione dell’espressione genica e sono in grado di influenzare il destino delle cellule staminali inducendo la downregolazione post-trascrizionale di centinaia di geni bersaglio. Infatti, i miRNA risultano coinvolti in diversi processi fondamentali delle cellule staminali, quali il self-renewal, la proliferazione ed il differenziamento; di conseguenza, la deregolazione dell’espressione dei miRNA può contribuire allo sviluppo di tumori solidi e neoplasie ematologiche.
Tra i miRNA la cui espressione risulta essere alterata in diversi tumori solidi e in una linea cellulare di Leucemia Mieloide Cronica (Chronic Myeloid Leukemia, CML) vi è miR-30e-5p, il quale in questo contesto cellulare sembrerebbe agire come un miRNA oncosoppressore. Tuttavia, il ruolo di miR-30e-5p nell’emopoiesi fisiologica rimane ancora da chiarire.
In questo lavoro di tesi, allo scopo di caratterizzare il ruolo di miR-30e-5p nel differenziamento mieloide di cellule staminali emopoietiche (Haematopoietic Stem Cell, HSC), abbiamo comparato l’espressione di miR-30e-5p nei vari lineages emopoietici attraverso l’analisi computazionale di alcuni datasets di campioni emopoietici presenti in letteratura ottenuti con la tecnologia microarray. Da tale analisi emerge come miR-30e-5p sia upregolato in cellule terminalmente differenziate della linea mieloide, quali granulociti, piastrine ed eritrociti. In seguito, abbiamo validato l’espressione del miRNA mediante Real Time PCR (qRT-PCR) in un nostro dataset di cellule emopoietiche ottenute da donatori sani, evidenziando nuovamente l’upregolazione di miR-30e-5p in granulociti.
Successivamente, tramite nucleofezione di miRNA mimic, abbiamo indotto l’overespressione di miR-30e-5p, in cellule staminali/progenitori emopoietici CD34+ isolate da sangue di cordone ombelicale. L’overespressione di miR-30e-5p in cellule CD34+ induce una diminuzione significativa dei precursori megacariocitari CD41+ e di cellule granulocitarie CD66b+, Inoltre, i saggi clonogenici in metilcellulosa e collagene confermano come l’upregolazione di miR-30e-5p sia in grado di ridurre la percentuale di colonie granulocitarie (CFU-G) e megacariocitarie (CFU-MK).
Allo scopo di identificare i geni targets di miR-30e-5p, abbiamo condotto un'analisi di microarray sugli stessi campioni di cellule CD34+ in cui è stato overespresso miR-30e-5p identificando una lista di geni differenzialmente espressi nel campione trattato con il miRNA rispetto al controllo. Mediante analisi computazionale, condotta con l’algoritmo TargetScan 7.1, siamo stati in grado di identificare diversi putativi mRNA targets di miR-30e-5p che sono downregolati in seguito all’espressione del miRNA e, che da letteratura, risultano coinvolti nella regolazione dell'emopoiesi o in alcune neoplasie ematologiche. Tramite saggi reporter di luciferasi abbiamo validato AFF3, HOXA1, IDH1, JDP2, PBRM1, CSNK1A1 e ERG come targets effettivi di miR-30e-5p. HOXA1 ed ERG sono ampliamente descritti in letteratura come importanti regolatori del differenziamento megacariocitario mentre, per quanto riguarda la granulocitopoiesi è molto meno chiaro quale tra questi geni possa essere coinvolto nella sua regolazione.
Complessivamente, i nostri risultati ci hanno permesso di svelare almeno in parte il ruolo di miR-30e-5p nel differenziamento mieloide, dimostrando che l’overespressione di miR-30e-5p inibisce sia il lineage granulocitario che quello megacariocitario. Inoltre, l’identificazione di diversi geni targets di miR-30e-5p ci permette di ipotizzare un meccanismo d’azione attraverso cui il miRNA regola il differenziamento mieloide che necessita tuttavia di ulteriori validazioni.
|
