Riassunto analitico
La corretta identificazione delle specie ha applicazione in diversi settori delle scienze sia di base che applicate. Nel caso specifico degli insetti, la corretta identificazione degli esemplari è fondamentale sia nel campo del controllo dei “pest”, sia nell’entomologia medica e forense. L’identificazione delle specie si realizza tramite due approcci, quello classico morfologico e quello più recente basato sul sequenziamento e confronto di alcune regioni nucleotidiche, sia mitocondriali che nucleari. Entrambi gli approcci hanno dei pro e dei contro. L’utilizzo dell’approccio morfologico per l’identificazione di insetti non sempre è possibile, soprattutto se ci si trova di fronte a frammenti di insetti o a stadi pre-immaginali, per i quali non sono disponibili chiavi dicotomiche complete. Dall’altra parte l’identificazione molecolare, è limitata dalle lacune presenti nei data base molecolari, dove non sono presenti le sequenze di tutte le specie. Il lavoro di tesi in questione si propone di valutare la capacità di metodi molecolari e statistici di identificare a livello di specie e raggruppare filogeneticamente esemplari di ditteri con particolare attenzione a quelli che si di sviluppano su materia organica di origine animale e che possono avere importanza sia nel settore del controllo delle infestazioni negli alimenti e nei locali di produzione/trasformazione/stoccaggio (in particolare negli allevamenti di bestiame e nei locali di lavorazione delle carni) che in quello dell’entomologia forense di stampo medico legale. Gli esemplari analizzati appartengono ad un campionamento eseguito nel periodo compreso tra il 2011 e il 2014 sul territorio italiano (Emilia Romagna e Veneto) e inglese (West Yorkshire). Gli esemplari sono stati inizialmente identificati morfologicamente e successivamente processati per l’identificazione molecolare. L’identificazione molecolare è stata effettuata utilizzando quattro diversi geni: due mitocondriali, COI e ND5, e due nucleari, EF-1α e PER, già utilizzati in letteratura per l’identificazione di specie. Le sequenze sono state ottenute attraverso sequenziamento diretto e l’identificazione di specie è stata effettuata con l’ausilio di BLAST e GenBank. La costruzione degli alberi filogenetici relativi alle specie analizzate è stata eseguita sia tramite Maximum Likelihood (ML) che Neighbour-Joining (NJ). Delle ottantaquattro specie analizzate, il 61,90% degli esemplari è stato campionato in Italia, mentre il 34,52% è stato campionato in Inghilterra a cui vanno aggiunti 3 esemplari di provenienza Belga. Gli esemplari analizzati appartengono a quattordici specie diverse, tra cui prevalgono Calliphora vicina e Lucilia sericata con il 29,76% e il 27,38% rispettivamente. L’analisi preliminare dei dati identificativi ottenuti dall’analisi del gene COI evidenzia una concordanza dell’identificazione molecolare con l’identificazione morfologica nel 83,33% dei casi. Maggior precisione nella identificazione dei campioni deriva dall’analisi della posizione delle sequenze nelle ricostruzioni filogenetiche. L’albero filogenetico costruito utilizzando le sequenze del gene mitocondriale COI rispecchia quanto già presente in letteratura e permette una corretta identificazione delle specie. Risultati interessanti derivano anche dall’analisi delle sequenze dei geni ND5, PER e EF-1α.
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Abstract
The identification of species plays an important role in several Science fields, from research to applied topics. In particular, the correct identification of insects is fundamental in pest-management, as well as in medical and forensic entomology. The identification of the species can be performed by two different approaches: the classic morphological identification, and the more recent molecular approach, based on sequencing and comparison of specific mitochondrial and nuclear nucleotide regions. Both the approaches have advantages and disadvantages. The classical morphological identification method is not always possible especially if the sample is composed by insect fragments or the insect is in an immature stage of development, because the lack of complete identification keys for immature stages of the majority of the species. On the other hand, the recent molecular identification method is limited by the lack of information in the sequence databases.
The aim of this thesis is to evaluate the ability of molecular and statistical methods for the identification to species level and for the phylogenetic grouping of samples of Diptera with a particular attention to flies that feed on animal organic matter. These species are related to pest management in food/feed production and storage, especially in livestock and meat processing premises, and with forensic entomology. The specimens analysed were collected between 2011 and 2014 in Italy (Emilia Romagna and Veneto) and England (West Yorkshire). Eighty four specimens were identified using a morphological approach, and subsequently processed to perform a molecular identification. The molecular identification has involved four different genes; two mitochondrial genes, COI and ND5, and two nuclear genes, EF-1α and PER. These four genes have already been used for the species identification in several research papers. The sequences were obtained by direct sequencing and the identification was performed using BLAST and GenBank. The phylogenetic trees on the species under study were built with Maximum Likelihood (ML) and Neighbour-Joining (NJ) parameters. Within the eighty four species analysed, 61.90% of the specimens were collected in Italy, 34.52% were collected in England, and three samples were Belgian. All the analysed specimens belong to fourteen different species; among them Calliphora vicina and Lucilia sericata were the most abundant species with 29.76% and 27.38% respectively. The preliminary analysis of the data from the identification with COI gene highlights a match between morphological and molecular identification in 83.33% of the specimens. A higher resolution in the identification of the species is obtained with the analysis of sequences in a phylogenetic tree. The phylogenetic tree corresponding to COI gene presented a pattern of grouping similar to the data present in literature, giving a correct identification of the specimens under analysis. Positive results have been found for ND5, EF-1α and PER genes.
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