Riassunto analitico
Il muscolo scheletrico è caratterizzato da una notevole capacità rigenerativa che deriva principalmente dalle cellule satellite (SCs), cellule staminali adulte, localizzate in una nicchia tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari. In condizioni normali le SCs sono mitoticamente quiescenti e caratterizzate dall’espressione del fattore trascrizionale Pax7, tuttavia in seguito a danno muscolare possono attivarsi e generare colonie di mioblasti che esprimono il determinante miogenico MyoD. Successivamente le SCs proliferanti spengono l’espressione di Pax7, mantenendo elevati i livelli di MyoD e attivando i fattori miogenici Miogenina e MRF4 per promuovere il differenziamento muscolare; infine le SCs si fondono fra loro o con le fibre danneggiate per generare nuove miofibre o per riparare quelle esistenti. Alcune SCs attivate non vanno incontro a differenziamento, ma tornano allo stato di quiescenza per ricostituire il pool di cellule staminali muscolari. La corretta attivazione del programma miogenico dipende anche dalla presenza di fattori trascrizionali appartenenti alla famiglia MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), in particolare è stato dimostrato che le proteine MEF2C e MEF2A contribuiscono a regolare l'espressione MyoD e al processo di rigenerazione muscolare. L’attività del fattore MEF2C è finemente modulata a vari livelli, ma alcuni aspetti di questa regolazione rimangono ancora non ben caratterizzati, per esempio MEF2C è già espresso in mioblasti proliferanti, dove però è trascrizionalmente silente finchè le cellule non vengono stimolate a uscire dal ciclo cellulare per differenziare. La fosforilazione delle proteine MEF2 nei cosiddetti motivi amminoacidici Ser/Thr-Pro può modulare la funzione delle proteine attraverso l'induzione di modificazioni conformazionali catalizzate dalla peptidyl prolyl cis/trans isomerasi Pin1. In passato nel nostro laboratorio sono stati individuati due siti fosfoaccettori di MEF2C, Ser98 e Ser110, situati nell’esone alternativo α1, essenziali per il legame con il repressore Pin1. Nel presente lavoro viene indagato un nuovo meccanismo di regolazione che coinvolge la fosforilazione MEF2C e l'interazione con Pin1 e che potrebbe rivestire un ruolo importante per consentire l'espansione del pool di SCs dopo l'attivazione, evitando un differenziamento prematuro. Ho dimostrato che la fosforilazione di MEF2C sui siti di legame per Pin1 influenza negativamente la funzione pro-miogenica di MEF2C e promuove la proliferazione. Ho inoltre combinato l'analisi della dinamica di fosforilazione MEF2C sulla Ser98 e Ser110 con lo studio del pattern di splicing alternativo del trascritto di mef2c durante la progressione miogenica delle SCS. In particolare ho notato che, nonostante MEF2C e Pin1 siano espressi in SCs quiescenti, proliferanti e differenziate, i requisiti necessari per l'interazione tra MEF2C e Pin1 sono soddisfatti esclusivamente nelle SC proliferanti, dove Pin1 è localizzato nel nucleo e l’isoforma MEF2Cα1 fosforilata su Ser98 e Ser110 inizia ad essere espressa; mediante saggio di complementazione bimolecolare (BiFC) ho dato prova dell'interazione fisica tra Pin1 e MEF2Cα1 in SC MyoD+. Inoltre l’espressione costitutiva di MEF2Cα1 o di Pin1 aumenta il tasso di proliferazione delle SCs, mentre con il mutante di fosforilazione di MEF2C il differenziamento miogenico viene accelerato. Nel complesso tali risultati mi permettono di ipotizzare che la fosforilazione dell’isoforma α1 di MEF2C sulla Ser98 e Ser110 e la conseguente interazione specifica con Pin1 gioca un ruolo importante nella regolazione delle SCs proliferanti, contribuendo a mantenere silente la trascrizione MEF2C-dipendente di geni muscolo-specifici per promuovere l'espansione delle SCs ed evitare un differenziamento precoce, garantendo così una corretta rigenerazione.
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Abstract
Skeletal muscle possesses remarkable regenerative capacity to repair muscle damage and the major contribution to skeletal muscle regeneration derives from satellite cells (SCs), adult stem cells located in a niche between the basal lamina and the sarcolemma of skeletal muscle fibers. In normal conditions SCs are mitotically quiescent and are characterized by the expression of the paired-box transcription factor Pax7, but upon muscle injury they can undergo rapid expansion, generating colonies of myoblasts that express MyoD, a member of the myogenic regulatory factors (MRFs) family. Later, satellite cell-derived myoblasts down-regulate Pax7, maintain MyoD and induce the MRFs Myogenin and MRF4 to promote differentiation and, finally, they fuse with each other or to existing myofibers to repair damage. Some of the activated SCs do not proliferate or differentiate, but self-renew and return to the quiescent state to replenish the SC pool.
Efficient activation of the differentiation program depends also on the presence of proteins belonging to the Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2) family, in particular it has been shown that MEF2C and MEF2A are expressed in SCs and contribute to regulate MyoD expression and muscle regeneration.
It is well known that MEF2C activity is finely modulated at several levels but some aspects of this regulation still remains uncharacterized; for example, MEF2C is already expressed in proliferating myoblasts, but it is transcriptionally silent unless the cells are stimulated to withdraw the cell cycle and differentiate.
Several studies demonstrated that phosphorylation of MEF2 factors at so-called Ser/Thr-Pro amminoacidic motifs can modulate protein function through the induction of conformational changes catalyzed by the peptidyl–prolyl cis/trans isomerase Pin1.
In the past we identified two novel critical phosphorylation sites in MEF2C, Ser98 and Ser110, located in the alternative spliced exon α1 and essential for the binding with the negative regulator Pin1.
In the present work I investigate a new regulatory mechanism of MEF2C that involves MEF2C phosphorylation and its interaction with Pin1, which might play an important role in allowing the expansion of SCs pool, preventing their premature differentiation.
I provide evidence that the phosphorylation of MEF2C on the Pin1 binding sites negatively affects MEF2C myogenic function and plays a positive role in promoting cell proliferation.
I analyzed the dynamics of MEF2C phosphorylation on Ser98 and Ser110 together with the alternative splicing pattern of mef2c transcripts during myogenic progression of SCs.
I showed that, although MEF2C and Pin1 are expressed in quiescent, proliferating and differentiating SCs, the conditions required for the interaction between MEF2C and Pin1 are satisfied exclusively in proliferating SCs, where Pin1 is nuclear localized and the MEF2C isoform with exon α1 phosphorylated on the Ser98 and Ser110 Pin1 binding sites specifically appears. I confirmed the physical interaction between Pin1 and MEF2Cα1 in MyoD+ SCs through a bimolecular complementation assay (BiFC). I observed that the constitutive over-expression of MEF2Cα1 or Pin1 increases the proliferation rate of SCs and that the infection with lentiviral vectors encoding for MEF2C protein mutated on the Pin1 binding sites accelerates myogenic differentiation.
Taken together these results lead us to speculate that phosphorylation of MEF2Cα1 isoform on Ser98 and Ser110 and the consequent interaction with Pin1 plays an important role in proliferating SCs, contributing to keep silent the MEF2C-dependent transcription of muscle specific genes and promoting the expansion of the SCs pool to prevent a precocious differentiation and to guarantee a proper regeneration.
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