Riassunto analitico
Introduzione. Nonostante siano state riportate associazioni tra la Sclerosi Multipla (SM) e le cellule Natural Killer T invarianti (iNKT), la patogenesi della malattia è ancora poco conosciuta. Le cellule iNKT sono potenti produttrici di citochine, hanno un potenziale immunoregolatorio e possono essere divise in sottopopolazioni funzionalmente distinte. Per chiarire meglio il loro ruolo nella SM, in modo particolare nelle diverse forme della malattia e nel suo trattamento, è necessaria una caratterizzazione più dettagliata delle sottopopolazioni di cellule iNKT (CD4+, CD8+ e CD4-CD8-, esprimenti o no il CD161). E’ stata recentemente individuata una popolazione di cellule T esprimenti il CD8 e il CD161. Tale popolazione è alterata nei pazienti affetti da SM. Lo scopo del nostro studio è quantificare queste cellule e le cellule iNKT nei pazienti affetti da diverse forme di SM e trattati con diverse terapie. Metodi. Sono stati arruolati dal Centro Sclerosi Multipla (NOCSAE, Modena) 66 pazienti: 52 con SM recidivante-remittente (RR; 46 in terapia, 6 senza trattamento), 9 con SM primariamente progressiva (PP) e 5 con SM secondariamente progressiva (SP). Come controlli (CTR) sono stati arruolati 26 soggetti sani paragonabili ai pazienti per età e sesso. Le cellule iNKT e CD8+,CD161+ sono state analizzate su PBMC freschi. Le cellule T CD3+ sono state contate utilizzando un citofluorimetro CyFlow Counter (Partec, Germania). Successivamente, i PBMC isolati sono stati marcati con diversi anticorpi monoclonali per l’analisi con un citofluorimetro dotato di focalizzazione acustica del flusso, elevata velocità e in grado di identificare 6 parametri fluorescenti (Attune, Life Technologies, USA), utilizzando diversi anticorpi monoclonali: anti-Vα24Jα18 TCR, -CD4, -CD8, -CD161, -CD3, -CD19 e -CD14. Sono state acquisite almeno 5 milioni di cellule per campione; i dati sono stati analizzati con i software FlowJo 9.6 e Stata 11.0 utilizzando i test Ranksum e ANOVA. Risultati. Il numero assoluto, ma non la percentuale, delle cellule iNKT è inferiore nei pazienti con forma RR rispetto ai CTR, mentre i pazienti con altre forme di SM mostrano un andamento simile. Tra le cellule iNKT, la sottopopolazione CD4+ è simile nelle diverse forme di SM e non differisce dalla frequenza osservata nei CTR, mentre la sottopopolazione CD8+ diminuisce in tutte le forme di SM rispetto ai CTR. La sottopopolazione CD4-CD8- è inferiore nella forma RR rispetto ai CTR. Tra le cellule iNKT, tutti i pazienti hanno valori inferiori di cellule CD8+CD161+. Il livello delle cellule T CD8+ è inferiore nei pazienti PP e SP rispetto a quello riscontrato nei CTR; il numero assoluto delle cellule T CD8+CD161+ (sia la sottopopolazione dim che bright) è inferiore nei pazienti SP rispetto ai CTR. Per quanto riguarda il ruolo del trattamento della SM, i pazienti RR in terapia con Fingolimod (un farmaco che blocca il recettore della sfingosina 1-fosfato S1PR1 e intrappola i linfociti nel linfonodo) hanno un numero assoluto di cellule T CD3+ più basso e una percentuale di cellule iNKT esprimenti il CD4 inferiore. I pazienti in terapia con natalizumab (che blocca l’α4 integrina), interferone o glatiramer acetato non dimostrano variabilità nei valori di iNKT rispetto ai CTR. Conclusioni. I cambiamenti nelle cellule iNKT e nelle loro sottopopolazioni nei pazienti con diverse forme di SM suggeriscono un ruolo per queste cellule nella patogenesi della malattia. Sono attualmente in corso studi funzionali per confermare questa ipotesi.
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Abstract
Introduction. The pathogenesis of Multiple Sclerosis (MS) is still poorly understood. Associations between MS and defects in invariant Natural Killer T (iNKT) cells have been reported, but contrasting data exist, due to methodological limitations. iNKT cells are potent cytokine producers, have immunoregulatory potential, and can be divided into functionally distinct subsets. A more detailed characterization of iNKT cell subsets (CD4+, CD8+ and CD4-CD8-, expressing or not CD161) is needed to better clarify their role in MS, particularly in different forms of the disease and its treatment.
Among T cells, a recently described population exists that has strong proinflammatory capacity (CD8+CD161+ T cells), and is altered in MS. Aim of our study was to evaluate the amount of these cells, along with that of iNKT, in different forms and treatments of MS.
Methods. We studied 66 patients followed by the MS Center (NOCSAE, Modena): 52 with a Relapsing Remitting (RR; 46 taking therapy, 6 without treatment), 9 with a Primary Progressive (PP) and 5 with a Secondary Progressive (SP) MS. 26 age- and sex-matched subjects were healthy controls (CTR). iNKT and CD8+,CD161+ cells were analyzed on fresh PBMC. CD3+ T cells were volumetrically counted using a CyFlow Counter (Partec, Germany). Then, isolated PBMC were stained with different mAbs for the analysis on a 6-color high speed acoustic focusing flow cytometer (Attune, Life Technologies, USA), using different mAbs, i.e. anti-Vα24Jα18 TCR, -CD4, -CD8, -CD161, -CD3, -CD19 and -CD14. A minimum of 5 million cells were acquired, and data analyzed by FlowJo 9.6 and Stata 11.0 softwares using Ranksum and Anova test.
Results. In comparison with CTR, MS patients with a RR form displayed a statistically significant lower number (but not percentage) of iNKT cells. Patients with other MS forms (whose number was lower) showed a similar trend. Among iNKT cells, the CD4+ subset did not vary in the different forms or in comparison to CTR, while the CD8+ subset was always diminished. The CD4-CD8- subset was significantly lower in the RR form compared to CTR. Among iNKT cells, the population of CD8+CD161+ cells was lower in all MS patients. When compared to CTR, PP and SP patients had a lower number and percentage of CD8+ T cells; CD8+CD161+ T cells (both dim and bright subset) were lower in all SP patients vs. CTR.
Concerning the role of MS treatment, RR patients taking Fingolimod (a drug that blocks the sphingosine-1-phosphate receptor S1PR1 and traps lymphocytes in the lymphnode) had a lower number of CD3+ T cells and a lower percentage of iNKT expressing CD4. Patients taking natalizumab (blocking α4 integrin), interferon or glatiramer acetate displayed no gross changes in iNKT cells in comparison with CTR.
Conclusion. The changes in iNKT cells and their subpopulations we observed in RR patients, along with the trends present in the other patients, suggest a role for these cells in the pathogenesis of MS. Functional studies are ongoing to better understand the activity of such cells.
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