Riassunto analitico
Il p-cresolo è un composto organico aromatico con struttura fenolica che si presenta come un solido incolore e dall’odore pungente. L'esposizione ambientale al p-cresolo è relativamente comune e si verifica attraverso la cute, il sistema gastrointestinale e le vie respiratorie. Nell’uomo la fonte più ampia e diffusa di questo composto è costituita da alcuni batteri intestinali, che esprimono specifici enzimi in grado di sintetizzarlo.
A causa del suo coinvolgimento in molteplici condizioni patologiche, l’interesse per il p-cresolo sta recentemente crescendo. Infatti, è stato osservato che i livelli di p-cresolo sono elevati in soggetti con autismo e in pazienti pediatrici che hanno alterazioni del microbiota intestinale. Questo composto pare possa contribuire anche ad alterazioni nella neurotrasmissione dopaminergica, che svolgono un ruolo chiave nella fisiopatologia e nella sintomatologia della sindrome post-traumatica da stress. In questa prospettiva, la determinazione di questa molecola a livello del SNC rappresenta un punto cruciale per fare luce sul suo ruolo nelle patologie citate. Risulta pertanto fondamentale avere a disposizione un metodo analitico sensibile ed accurato che permetta di poter determinare qualitativamente e quantitativamente il p-cresolo in campioni di tessuto cerebrale.
Alla luce di ciò, l’obiettivo di questa tesi sperimentale di Laurea Magistrale di Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stato quello di sviluppare e ottimizzare un metodo analitico altamente efficiente per la determinazione del p-cresolo a livello di campioni di tessuto cerebellare di topo, basato sulla tecnica combinata GC-MS, vista la volatilità di questo composto, senza l’utilizzo di agenti derivatizzanti e limitando quindi fonti di errore sperimentale. Questo metodo analitico si pone in alternativa alla tecnica combinata HPLC-MS/MS, già utilizzata e validata a questo scopo, che tuttavia necessita della derivatizzazione del composto.
Per quanto riguarda la preparazione del campione, in seguito alla precipitazione delle proteine, si è applicata la procedura della in-vial dual extraction, che consiste in un’estrazione liquido-liquido tra una fase acquosa ed una fase organica, direttamente nel vial per l’analisi GC-MS per limitare la perdita di composto. E’ stata valutata l’efficienza estrattiva di diversi solventi organici, tra i quali il metil-tert-butil etere (MTBE) è risultato il migliore in termini di recovery. Il metodo analitico GC-MS per la determinazione del p-cresolo è stato opportunamente ottimizzato nei parametri sperimentali e l’acquisizione del segnale è stata realizzata in modalità Single Ion Monitoring (SIM) per aumentare la sensibilità.
Il metodo estrattivo e analitico è stato poi applicato a tessuti cerebellari di topo appartenenti a tre differenti gruppi sperimentali, sottoposti o meno ad un evento traumatico, fornendo risultati molto promettenti. Per il prossimo futuro, il passo successivo sarà validare la procedura sviluppata secondo le linee guida ICH e finalizzare l’analisi quantitativa di p-cresolo in diversi tessuti del SNC.
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