Riassunto analitico
La resistenza batterica rappresenta uno dei principali rischi per la salute a livello mondiale: la comparsa di nuovi meccanismi di resistenza e la loro rapida diffusione hanno reso le infezioni batteriche difficilmente trattabili. Tra i molteplici meccanismi impiegati dai batteri per contrastare i trattamenti antibiotici, un ruolo centrale è ricoperto dalla produzione di carbapenemasi di tipo serinico e metallo-β-lattamasi, enzimi in grado di idrolizzare la maggior parte degli antibiotici β-lattamici attualmente disponibili, compresi i carbapenemi di ultima generazione. La produzione di tali enzimi da parte dei batteri, definiti “superbugs” per l’elevata capacità idrolitica, rappresenta un significativo problema dal punto di vista clinico compromettendo notevolmente l’efficacia dei trattamenti antibiotici disponibili. Mentre per le β-lattamasi di classe A, C e D, caratterizzate da una serina catalitica, sono disponibili in terapia diverse tipologie di inibitori, per le metallo-β-lattamasi di classe B non è stato ancora approvato alcun farmaco. Per far fronte al potenziale rischio di fallimento terapeutico antibiotico e sormontare il problema della resistenza, c’è un ingente bisogno di sviluppare nuovi antibiotici ed efficaci inibitori delle β-lattamasi.
Il mio progetto di tesi si inserisce all’interno di tale problematica, focalizzandosi prevalentemente sulla scoperta di nuovi inibitori attivi verso le carbapenemasi di classe A e di classe B. È stato effettuato uno screening in silico mediante un approccio di docking molecolare (GLIDE) su una libreria di composti caratterizzati da una porzione 5-oxopirrolidina-3-carbossilica. Target dei miei studi sono state KPC-2, appartenente alla classe A, e NDM-1, classe B. Il docking è stato supportato da studi preliminari riguardanti sia le molecole di acqua coinvolte nel meccanismo idrolitico delle β-lattamasi sia relativi alla flessibilità dei residui amminoacidici nel sito attivo responsabili nell’attività carbapenemasica. I candidati più promettenti sono stati testati in vitro mediante spettrofotometria UV-Vis e per i composti più attivi sono stati determinati i valori di IC50 e Ki.
In aggiunta, una nuova serie di 4-amino-1,2,4-triazoli-3-tioni, recentemente identificati come inibitori ad ampio spettro verso la classe A (KPC-2) e la sottoclasse B1 (VIM-1 e IMP-1), è stata testata in vitro verso un gruppo di carbapenemasi di classe A, KPC-2 e GES-5, e di classe B, tra cui NDM-1, VIM-1, VIM-2 e IMP-1. Per gli inibitori più attivi sono stati determinati i valori di IC50 e Ki; è stata infine predetta l’orientazione di legame attraverso il docking molecolare, confermata successivamente dalla cristallografia a raggi X.
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Abstract
Bacterial Resistance represents one of the greatest threats to global health: new resistance mechanisms are emerging and spreading worldwide, making infectious diseases very difficult to treat.
Among the several mechanisms that bacteria exert to cope with chemotherapy, serine/metallo-carbapenemase-coproducing pathogens, often referred to as “superbugs”, are a significant clinical problem. They hydrolyze nearly all available β-lactam antibiotics, including the last resort carbapenems, seriously endangering efficacious antibacterial treatments.
Actually, only inhibitors active against serine-based-β-lactamases (class A, C, D) are available in therapy, while no inhibitors active against metallo-β-lactamases (class B) have been so far approved for treatment. To face the risk of antibiotic treatment failure and overcome resistance, there is a huge need to discover new antibiotics and effective β-lactamases inhibitors.
In this scenario, my thesis work has been focused on the structure-based discovery of novel inhibitors against class A and class B carbapenemases. Firstly, a library of in-house available compounds carrying a 5-oxopyrrolidine-3-carboxylic acid motif was screened in silico through molecular docking (GLIDE) against KPC-2, belonging to Class A, and NDM-1, Class B. The performed docking studies were supported by preliminary studies on relevant waters mechanistically involved in β-lactamases mechanism of hydrolysis and on the flexibility within the active site of residues involved in the carbapenemases spectrum of action. Most promising candidates were then validated in vitro by UV-Vis spectrophotometric assays and for active inhibitors IC50 and Ki were determined.
Additionally, a novel series of 4-amino-1,2,4-triazole-3-thiones, recently disclosed as broad-spectrum inhibitor of class A KPC-2 and subclass B1 VIM-1 and IMP-1, were tested in vitro against a panel of carbapenemases, including class A BL, KPC-2 and GES-5, and class B, NDM-1, VIM-1, VIM-2 and IMP-1. For best inhibitors, IC50 and Ki were determined, their binding orientation was predicted by molecular docking and then confirmed by x-ray crystallography.
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