Riassunto analitico
SARS-CoV-2 è un nuovo Betacoronavirus che causa la malattia denominata COVID-19, presentando i primi sintomi come febbre, affaticamento e tosse secca. Osservato per la prima volta a dicembre 2019 nella provincia cinese di Wuhan, il virus si è diffuso rapidamente a livello globale. La gravità del COVID-19 ha avuto un forte impatto con co-morbilità tra cui ipertensione, diabete, cancro e malattie polmonari. SARS-CoV-2 colpisce organi come cuore, reni, fegato, sistema neurologico, ecc, ma infetta principalmente i tessuti respiratori. La struttura delle vie aeree e il suo epitelio cambiano ampiamente dalle cavità nasali agli alveoli. Gli epiteli all'interno di ciascuna zona delle vie aeree conduttrici sono composti da tipi distinti di cellule epiteliali, portando a una difficile comprensione del meccanismo di infezione e replicazione di SARS-CoV-2. Le linee cellulari e gli animali sono due modelli principali per lo studio dell'infezione virale, ma non imitano completamente la risposta biologica nelle cellule primarie umane. Pertanto, una definizione di un modello in vitro di cellule respiratorie primarie umane è fondamentale per la comprensione della malattia e del danno prodotto dal virus come biologia di questo nuovo coronavirus. Quindi, in primo luogo, abbiamo affrontato le nostre indagini sull'espressione di ACE2 e TMPRSS2 poiché queste proteine sono coinvolte nella via principale dell'infezione virale. Sono state analizzate diverse linee cellulari tumorali confrontandole con Calu3, la linea cellulare standard utilizzata per gli studi sul coronavirus. I risultati sono stati confermati anche dal silenziamento del siRNA. Successivamente, abbiamo studiato l'espressione di ACE2 e TMPRSS2 mediante test di immunofluorescenza in diversi campioni di epiteli in vivo, inclusi i distretti delle vie aeree (naso, trachea e bronchi). Le differenze tra i campioni dei pazienti erano evidenti anche negli stessi epiteli, confermando la variabilità interpersonale che necessita di ulteriori studi. Infatti, le differenze genetiche tra gli individui possono alterare la risposta all'infezione da SARS-CoV-2, evidenziando il concetto di medicina personalizzata, pertanto abbiamo eseguito l'analisi Real-Time PCR e Western Blot per schermare diverse colture epiteliali umane derivate da nasali, tracheali e bronchi per valutare il loro livello di espressione di ACE2. Abbiamo quindi selezionato un donatore tracheale come modello cellulare primario per esperimenti di infezione proof-of-principle. Le colture cellulari sommerse e le colture dell'interfaccia aria-liquido, in cui le cellule si differenziano e formano un epitelio ciliato pseudostratificato, sono state allestite e quindi infettate con SARS-CoV-2 in una stanza BSL-3. L'infezione è stata valutata da FISH in diversi MOI e punti temporali e il coinvolgimento dei tipi cellulari è stato studiato attraverso marcatori specifici. Per confermare le differenze interindividuali di sensibilità all'infezione da coronavirus, sono state utilizzate cellule delle vie aeree di un donatore ad alta espressione di ACE2 che mostrano un aumento dei foci FISH. In conclusione, abbiamo definito un modello in vitro di cellule epiteliali primarie delle vie aeree umane per lo studio dell'infezione da SARS-CoV-2, dando la possibilità di espandere gli studi alle diverse varianti virali. Infine, questo modello in vitro può essere utilizzato per lo studio di altri virus respiratori e per la scoperta di nuovi farmaci.
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Abstract
SARS-CoV-2 is a novel Betacoronavirus that causes the disease named COVID-19, presenting first symptoms such as fever, fatigue, and dry cough. First observed in December 2019 in Wuhan Province of China, the virus rapidly spread globally. The severity of COVID-19 highly impacted with co-morbidities including hypertension, diabetes, cancer, and lung diseases. SARS-CoV-2 affects organs like heart, kidneys, liver, neurological system, etc, but primarily infects respiratory tissues.
The airway structure and its epithelium widely change from the nasal cavities to the alveoli. The epithelia within each zone of the conducting airway are composed with distinct types of epithelial cells, leading to difficult comprehension of SARS-CoV-2 mechanism of infection and replication.
Cell lines and animals are two major models for studying viral infection, but they do not completely mimic the biological response in human primary cells. Therefore, a definition of an in vitro model of human primary respiratory cells is crucial for the comprehension of the disease and damage produced by the virus as the biology of this novel coronavirus.
Hence, we firstly addressed our investigations on ACE2 and TMPRSS2 expression since these proteins are involved in the major route of viral infection. Several tumour cell lines were analysed comparing them to Calu3, the standard cell line used for coronavirus studies. The results were confirmed also by siRNA silencing.
Afterwards, we investigated ACE2 and TMPRSS2 expression by immunofluorescence assay in different in vivo epithelia samples, including the airways districts (nose, trachea, and bronchi). Differences between patient samples were evident even in the same epithelia, confirming interpersonal variability that needs further studies. Indeed, inter-individuals’ genetic differences can alter the response to SARS-CoV-2 infection, highlighting the concept of personalized medicine, therefore we performed Real-Time PCR and Western Blot analysis to screen different human epithelial cultures derived from nasal, tracheal and bronchi to assess their level of ACE2 expression. We then selected one tracheal donor as the primary cell model for proof-of-principle infection experiments.
Submerged cell cultures and air-liquid interface cultures, where cells differentiate and form a pseudostratified ciliated epithelium, were set up and then infected with SARS-CoV-2 in a BSL-3 room. Infection was evaluated by FISH at different MOI and time points, and involvement of cell types was studied through specific markers. To confirm the inter-individual differences of sensitivity to coronavirus infection, airway cells from an ACE2-highly expressing donor were used showing an increase of FISH foci.
In conclusion, we defined an in vitro model of human primary airway epithelial cells for studying SARS-CoV-2 infection, giving the possibility to expand the studies to the different viral variants. Finally, this in vitro model can be used for studying other respiratory viruses and for new drug discovery.
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