Riassunto analitico
Storicamente i lieviti della specie Zygosaccharomyces rouxii sono ceppi aploidi osmo e alotolleranti, che divergono da S. cerevisiae prima di una duplicazione del genoma (WGD), avvenuta nella famiglia Saccharomycetaceae 100 milioni di anni fa. La presente tesi si propone di studiare, mediante un approccio multifasico, la complessità genomica e la diversità fenotipica in un pool di ceppi di Zygosaccharomyces collettivamente descritti come complex Z. rouxii. Una nuova specie diploide correlata a Z. rouxii, Zygosaccharomyces sapae, è stata delineata. Lo studio comparativo polifasico di Z. sapae (ceppi ABT301T e ABT601) e ceppi depositati come Z. rouxii (CBS 732T, ATCC 42981, CBS 4837, CBS 4838 e OUT7136) evidenzia variabilità nel numero di cromosomi, dimensione del genoma e ploidia e divergenza in marcatori housekeeping e filogenetici. Z. rouxii complex si distingue in tre clusters, uno aploide di Z. rouxii (ceppo CBS 732T), il cluster diploide di Z. sapae e quello allodiploide/aneuploide (ATCC 42981, CBS 4837, CBS 4838 e OUT7136). Tutti i ceppi, con l’eccezione di CBS 732T, mostrano un’estesa eterogeneità intragenomica negli arrays rDNA, con indels/sostituzioni principalmente nelle regioni spaziatrici trascritte interne (ITS). Questi risultati indicano che i ceppi sono difettosi nei meccanismi di evoluzione concertata che omogeneizzano copie intra–ceppo di array rDNA, suggerendo un processo evolutivo “birth and death”. Quando un bacino più ampio di ceppi è screenato per l’eterogeneità ribosomale, 10 ceppi su 78 hanno mostrato mancanza di evoluzione concertata nei domini D1/D2 26S e nelle regioni ITS-5.8S. L’analisi quantitativa della risposta fenotipica a 15 perturbazioni ambientali è stato condotta con il software grofit. I ceppi ATCC 42981, CBS 4837 e CBS 4838 hanno mostrato un resistenza cationi metallici alcalini ed una capacità di crescita in glicerolo superiori a ABT301T e ABT601. L’indice logaritmico di crescita (basato su valori di μ) ha evidenziato come il ceppo ABT601 sia a lenta crescita ma poco sensibile alle condizioni di stress, mentre ABT301T ha una crescita più rapida in condizioni standard ma più sensibile alle condizioni sub-optimali. Il ciclo vitale e il sistema di mating sono forze evolutive trainanti la diversità genomica e funzionale dei lieviti. Sulla base della variabilità genetica e funzionale del complex Z. rouxii, si ipotizza che all’intero del gruppo il mating fra cellule aploidi eterotalliche divergenti possa risultare in progenie diploidi che danno origine a linee diploidi o allodiploidi/aneuploidi. Per confermare l’ipotesi, è stato studiato il sistema di determinazione del sesso nel ceppo ABT301T. Sono stati clonati tre loci MATα-idiomorfi divergenti (ZsMATa2a1_1, ZsMATa2a1_2, e ZsMATa2a1_3) e un singolo locus ZsMATA2A1 Z. rouxii-like. Inoltre, ABT301T possiede 2 geni HO divergenti codificanti per l’endonucelasi Ho (rispettivamente 92% e 100% di identità nelle sequenze aa rispetto a Z. rouxii). Per determinare la struttura a tre cassette (MAT, HML, HMR), abbiamo sequenziato le regioni fiancheggianti i loci idiomorfici MATa and MATA. Tutti i loci ZsMATa2a1 e ZsMATA2A1 hanno mostrato una organizzazione conservata DIC1-MAT-SLA2, identica a Z. rouxii. Inoltre, sono state individuate quattro putative cassette HML: una contiene la sequenza ZsMATa2a1_2 e le regioni fiancheggianti della cassetta Z. rouxii HML, le rimanenti tre (ZsMATa2a1_1, ZsMATa2a1_2, and ZsMATa2a1_3) divergono nella regione 3' da Z. rouxii. I dati supportano che ABT301T sia un ceppo Aaaa eterozigote che ha perso la cassetta HMR. La presente Tesi di Dottorato mostra come il ciclo vitale e il sistema di mating influenzino la diversità funzionale e genetica del complex Z. rouxii, rendendolo un modello promettente per studiare evoluzione genomica in lieviti pre-WGD.
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Abstract
Zygosaccharomyces rouxii traditionally includes osmotolerant and halotolerant haploid yeasts, which emerged from the S. cerevisiae lineage prior to a whole genome duplication (WGD) event occurred in Saccharomycetaceae family 100 million years ago. In this thesis, we applied multi-phasic approaches to elucidate the molecular basis of genomic complexity and functional diversity in a pool of selected Zygosaccharomyces strains, referred as Z. rouxii complex. Firstly, we delineated a novel diploid species related to Z. rouxii, namely Zygosaccharomyces sapae. Subsequently, a polyphasic comparative analysis of Z. sapae (strains ABT301T and ABT601) with strains deposited in culture collection as Z. rouxii (CBS 732T, ATCC 42981, CBS 4837, CBS 4838 and OUT7136) was performed, which revealed that the Z. rouxii complex strains show variability with respect to chromosome number, genome size, ploidy and sequences of housekeeping and phylogenetic markers. Our finding demonstrated that Z. rouxii complex could be split up into three lineage, namely haploid lineage Z. rouxii (CBS 732T), diploid Z. sapae, and allodiploid/aneuploid lineage comprising ATCC 42981, CBS 4837, CBS 4838 and OUT7136. Moreover, an extent pattern of rDNA heterogeneity was observed in intragenomic copies of rDNA array in all strains of Z. rouxii complex, with exception of CBS 732T, with indels/substitutions occurring mainly in internal transcribed spacer regions (ITS). These finding indicated that the strains are defective in mechanisms driving intra-strain homogenization by concerted evolution, suggesting a birth and death process of evolution. When a wider pool of Z. rouxii strains were screened on the basis of rDNA heterogeneity in D1/D2 26S and ITS-5.8S rDNA, 10 out of 78 strains showed lack of concerted evolution in rDNA array.
A quantitative profiling of Z. rouxii complex strains was carried out in response 15 environmental perturbations using statistical tool grofit. ATCC 42981, CBS 4837 and CBS 4838 displayed alkali metal cations resistance and glycerol respiration higher than ABT301T and AB601. μ-based logarithmic phenotypic index highlighted that ABT601 is a slow-growing organism insensitive to stress perturbation, whereas ABT301T grows fast on rich medium and is sensitive to sub-optimal conditions.
The life cycle and the mating system have been reported as the major evolutionary forces driving genetic and functional diversity in yeasts. In context to Z. rouxii complex strains, we hypothesized that mating between the highly divergent haploid, heterothallic parent cells could have resulted in diploid progenies with high genome complexity that subsequently lost the ability to undergo meiosis and given rise to diploid (Z. sapae) and allodiploid/aneuploid (ATCC 42981, CBS 4837, CBS 4838, OUT7136) strains. To test this hypothesis, we investigated sex-determination system in ABT301T. We cloned three divergent MATα-idiomorph loci (ZsMATa2a1_1, ZsMATa2a1_2, and ZsMATa2a1_3) and a single ZsMATA2A1. ABT301T possesses two divergent HO endonuclease genes (92% and 100% aa sequence identities compared to Z. rouxii). To establish the three-cassette structure (MAT, HML, HMR), we analyzed the flanking regions of MATa and MATA-idiomorph loci. ZsMATA2A1 and all ZsMATa2a1 loci exhibited a conserved DIC1-MAT-SLA2 organization, identical to Z. rouxii. Moreover, four putative HML cassettes were identified: one containing sequence ZsMATa2a1_2 and Z. rouxii flanking regions; the remaining three (ZsMATa2a1_1, ZsMATa2a1_2, and ZsMATa2a1_3) are divergent in 3’ regions from Z. rouxii. In conclusion, ABT301T is a highly heterozygous Aaaa strain which has lost HMR.
The results presented in this thesis globally provide evidences of evolutionary impact of life cycle and mating systems on genetic and functional diversity in Z. rouxii complex strains, which represents a promising model for studying genome evolution in pre-WGD yeasts species.
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