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Le cellule tumorali mostrano un'alterazione del metabolismo mitocondriale con uno spostamento del bilancio energetico dalla fosforilazione ossidativa verso la via glicolitica, allo scopo di favorire la sopravvivenza e proliferazione cellulari. L’ambiente ricco di stimoli di stress in cui risiedono le cellule tumorali può facilitare la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che rappresentano una fonte di danno sia per le proteine che per il DNA mitocondriali. Per questo motivo, un'efficiente eliminazione delle proteine danneggiate è cruciale per prevenire questo processo nocivo.
Lon è una proteasi mitocondriale ATP-dipendente, codificata a livello nucleare, che degrada proteine danneggiate, assiste il folding proteico e partecipa al mantenimento dei livelli del DNA mitocondriale (mtDNA). L’espressione di Lon è aumentata in alcune tipologie di cancro e questo aumento sembra essere utile per la proliferazione delle cellule tumorali e il loro adattamento a condizioni di stress (ad esempio ipossia e stress ossidativo). La diminuzione dell’espressione di Lon, invece, induce un aumento della morte cellulare, probabilmente a causa dell’accumulo di aggregati proteici nei mitocondri che influenzano l’attività dell’organello.
Sirt3 è la principale deacetilasi mitocondriale e regola importanti vie metaboliche mediante l'acetilazione dei residui di lisina di proteine bersaglio. Alterazioni nei livelli di Sirt3 risultano essere un requisito cruciale nel meccanismo di tumorigenesi, presumibilmente per conferire un vantaggio metabolico alle cellule tumorali, così come per promuovere il sistema di risposta allo stress ossidativo. Tuttavia, le conoscenze riguardo i substrati mitocondriali di Sirt3 sono ancora limitate.
Lo scopo dello studio è stato quello di caratterizzare le alterazioni mitocondriali in tre modelli di cancro, in particolare la linea di carcinoma colorettale RKO, la linea di carcinoma epatocellulare HepG2 e la linea di adenocarcinoma mammario MCF7, nelle quali Lon è stato farmacologicamente inibito mediante trattamento con il triterpenoide acido oleanico 2-ciano-3,12-diossioleanico-1,9(11)-diene-28oato (CDDO), o il suo derivato metilato CDDO-Me. Inoltre si è indagato sulla possibile interazione tra la proteasi Lon e Sirt3, dal momento che entrambi svolgono ruoli fondamentali nello sviluppo tumorale.
Innanzitutto abbiamo dimostrato che il trattamento con CDDO o CDDO-Me comportava una diminuzione nei livelli di espressione di Lon in maniera dose-dipendente. Le cellule trattate hanno mostrato una diminuita proliferazione cellulare e aumentate apoptosi e necrosi. Abbiamo osservato un aumento nei livelli mitocondriali di anione superossido e una notevole depolarizzazione della membrana mitocondriale. Inoltre, una diminuita trascrizione del mtDNA suggeriva una compromissione della funzionalità mitocondriale. Questa situazione anomala si rifletteva nella morfologia dell'organello, come osservato in microscopia confocale.
Per quanto riguarda Sirt3, i risultati delle analisi di immunofluorescenza e co-immunoprecipitazione supportano l'idea di una possibile interazione con Lon che sembra aumentare in un ambiente ricco di stimoli di stress, ipotesi ulteriormente rafforzata dai dati in silico.
Concludendo, i dati mostrano che Lon è essenziale per mantenere la funzionalità e la morfologia mitocondriale, la cui alterazione influenza la sopravvivenza di diversi tipi di cellule tumorali. In questo contesto, Sirt3 può rappresentare il master regulator dell'omeostasi tumorale mediante acetilazione di Lon. Questi risultati evidenziano quindi nuovi aspetti della regolazione di Lon, ponendo le basi per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici nel trattamento del cancro.

Tumour cells exhibit a mitochondrial metabolic shift from oxidative phosphorylation to glycolytic pathway, thus supporting cell proliferation and survival. The stressful environment of proliferating tumours can facilitate reactive oxygen species (ROS) production that represent a source of damage for mitochondrial proteins and DNA. Thus, an efficient turnover of damaged proteins is crucial for preventing this dangerous process. Lon is a nuclear-encoded, mitochondrial ATP-dependent protease that degrades oxidized damaged proteins, assists protein folding and participates in maintaining mitochondrial DNA levels. Lon is upregulated in some cancer types, and its upregulation appears to be useful for proliferation of cancer cells and their adaptation to a stressful environment (e.g. hypoxia and oxidative stress). Conversely, Lon downregulation in cancer cells enhances cell death, probably due to accumulation of protein aggregates in the mitochondria, which in turn affects organelle functionality. Sirt3 is the major mitochondrial deacetylase, regulating important metabolic pathways through the lysine acetylation of target proteins. Alteration in Sirt3 levels emerged to be a crucial step in carcinogenesis process, as it confers metabolic benefit to tumour cells and improves antioxidant defense system. However, little is known about the substrates of Sirt3 in mitochondria. The aim of this study was to characterize mitochondrial alterations in three cancer cell models, namely RKO colon carcinoma line, HepG2 liver hepatocellular carcinoma line and MCF7 breast adenocarcinoma line, in which Lon was pharmacologically inhibited by the treatment with the triterpenoid oleanolic acid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28oat (CDDO), or its methylated derivative CDDO-Me. Moreover, we investigated a possible interaction between Lon protease and Sirt3, as they both play important roles in tumour development. Firstly, we demonstrated that the treatment with both CDDO or CDDO-Me decreases Lon expression in a dose-dependent manner. Treated cells showed a reduced proliferative rate along with an increase in apoptosis and necrosis. We observed an increase in mitochondrial anion superoxide and a remarkable depolarization of mitochondrial membrane. Moreover, low levels of mtDNA trascripts suggested an impairment of mitochondrial functionality. Mitochondria morphology reflects this altered situation, as observed by confocal microscopy. Concerning Sirt3, results derived from immunofluorescence and co-immunoprecipitation analysis support the hypothesis of an existing interaction with Lon that seems to be enhanced by a stressful environment, further strengthened by in silico data. In conclusion, our data show that Lon is essential for correct mitochondrial morphology and functionality, whose impairment alters the survival of different types of cancer cells. In this context, Sirt3 could represents the master regulator of tumour homeostasis through Lon acetylation. These results highlight new aspects of Lon regulation, thus paving the way to new therapeutic approaches for cancer treatment.