• expression
• gene-regulation
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• transcription

Il fattore di trascrizione NF-Y è un complesso eterotrimerico evolutivamente conservato, composto dalle subuntà NF-YA, NF-YB e NF-YC. Sebbene solo NF-YA possieda il dominio di legame al DNA, tutte le subunità sono necessarie per il reclutamento specifico alla sequenza CCAAT, un elemento regolativo presente in circa il 30% dei promotori eucariotici. La formazione del dimero NF-YB/NF-YC, mediata dall’interazione tra i rispettivi Histone Fold Motifs, è un prerequisito indispensabile per il legame di NF-YA e, di conseguenza, per il riconoscimento della CCAAT box.
Mentre un unico trascritto è stato descritto per NF-YB, i geni codificanti per NF-YA e NF-YC, le due subunità dotate di dominio di trans-attivazione, sono soggetti a splicing alternativo. NF-YA presenta due isoforme denominate NF-YAshort e NF-YAlong, che differiscono per una regione di 28 aminoacidi nel dominio di trans-attivazione. NF-YC invece presenta quattro varianti di splicing che producono proteine diverse identificate in base al loro peso molecolare, nello specifico la forma canonica da 37 kDa, e le tre varianti da 39 kDa, 48 kDa e 50 kDa. Il locus di NF-YC presenta inoltre due diversi promotori, chiamati P1 e P2, la cui regolazione non è ancora ben chiara. L’analisi dei dati di ChIP-seq, all’interno del progetto ENCODE, ha permesso di identificare il legame di NF-Y ai promotori delle sue stesse subunità, suggerendo una possibile regolazione NF-Y dipendente.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di identificare i meccanismi molecolari che controllano l’espressione delle tre subunità di NF-Y sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale.
Per prima cosa, abbiamo dimostrato che i livelli proteici di NF-YB e NF-YC sono controllati dalla presenza del reciproco partner: esperimenti di RNA interference mostrano chiaramente come NF-YB e NF-YC siano destabilizzati dal silenziamento della reciproca subunità con cui dimerizzano.
Successivamente, ci siamo focalizzati sulla regolazione trascrizionale di NF-YB e NF-YC da parte di NF-Y stesso. Mediante esperimenti di ChIP abbiamo confermato che NF-Y è legato ai promotori di NF-YB e NF-YC. I nostri studi, condotti in cellule dopo inattivazione di NF-YA, hanno permesso di determinare che NF-Y controlla negativamente la trascrizione delle sue subunità, presumibilmente reclutando repressori trascrizionali, quali il complesso Sin3a/HDAC1 o l’oncosppressore p53.

The transcription factor NF-Y is a highly conserved heterotrimeric complex that binds the CCAAT box, a common cis-acting regulatory element found in promoters and enhancers of a large number of genes in higher eukaryotes. NF-Y is composed of three subunits NF-YA, NF-YB and NF-YC, all necessary for DNA binding. NF-YB and NF-YC harbor common conserved regions called Histone Fold Motifs (HFMs), through which they can dimerize and form a histone-like pair. This is a prerequisite for the binding of NF-YA, which is the subunit that gives DNA recognition specificity to the trimer. While NF-YB has a unique transcript, NF-YA and NF-YC, which contains transactivation domains, display different splice variants. The NF-YA gene encodes for two isoforms, NF-YAshort and NF-YAlong, which differ in a 28 aa region within the transactivation domain. NF-YC presents three splice variants besides the canonical 37 kDa isoform: a 39 kDa, a 48 kDa and a 50 kDa isoform. NF-YC locus is characterized by the presence of two different promoters, namely P1 and P2, which are thought to be differentially regulated. The analysis of ENCODE ChIP-seq data highlights the binding of NF-Y on regulatory regions of its subunits, thus suggesting that a self-regulative loop might control NF-Y expression. The aim of this work was to identify the molecular mechanisms controlling the expression of the three NF-Y subunits, both at transcriptional and post-transcriptional level. First, we demonstrated that NF-YB and NF-YC protein levels are controlled by the presence of their reciprocal partner: RNA interference experiments clearly showed that NF-YB and NF-YC are destabilized by the inactivation of their histone fold partner. Second, we focused on the NF-Y-dependent transcriptional regulation of NF-YB and NF-YC. Through ChIP assays we proved that NF-Y is associated to NF-YB and NF-YC regulatory regions. Our studies in NF-YA inactivated cells demonstrated that NF-Y negatively controls gene transcription of its own subunits, presumably by recruiting transcriptional repressors, such as the Sin3a/HDAC1 complex and the oncosuppressor p53.