• distribuzione
• endocitosi
• Nanoparticelle
• neuronale
• uptake

Lo sviluppo delle nanotecnologie e la sintesi di nuovi polimeri chimici non tossici, biodegradabili e biocompatibili hanno portato allo creazione di sistemi “sintetici” di trasporto di farmaci, non invasivi, noti come nanocarrier diretti a diverse parti del corpo compreso il cervello.
Il PolyLactideCoGlycolide (PLGA) rappresenta il più importante polimero sintetico sviluppato per la formulazione di nanoparticelle (NPs) il cui utilizzo come sistema di trasporto del farmaco è stato approvato per somministrazione parenterale dalla European Medicine Agency riducendo i tempi per l’applicabilità nella clinica umana. Perchè l’utilizzo di “smart drug carriers” sia esteso all’ambito neurologico è necessario studiare accuratamente sia la distribuzione sia l’interazione con le cellule del sistema nervoso centrale (SNC).
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di studiare la biodistribuzione in vivo di PLGA-NP, modificate con g7 (g7-NP) un glicopeptide che permette il passaggio della barriera emato-encefalica (BEE), l’interazione con cellule nervose e il meccanismo mediante il quale le g7-NP sono trasportate all’interno delle cellule.
Caratterizzate dal punto di vista chimico e fisico, le g7-NP sono state iniettate nel peritoneo (i.p.) di topi C57bl6. Mediante microscopia confocale, abbiamo individuato le specifiche aree cerebrali e cellule che accumulano le g7-NP. A sei ore dall’iniezione, le g7-NP sono distribuite in maniera eterogenea nel cervello sia nella sostanza grigia che in quella bianca. Tra le aree positive all’accumulo di g7-NP, abbiamo analizzato in dettaglio la regione ippocampale rivelando che la maggior parte di cellule positive alle g7-NP sono neuroni NeuN positivie cellule microgliali Iba1 positive, mentre solo raramente, le g7-NP erano localizzate in astrociti GFAP positivi. Mentre la distribuzione nei tipi cellulari non cambia nel tempo (da 10 minuti a 5 giorni), l’accumulo di g7-NP ha il picco a 30 minuti e diminuisce nel tempo rimanendo poi stabile fino a 5 giorni dopo la somministrazione i.p.
Per individuare il possibile meccanismo di captazione delle g7-NP nel cervello in vivo, basandoci sui dati in vitro, abbiamo inibito selettivamente il trasporto clatrina dipendente nell’ippocampo di topo mediante iniezione intracerebrale di clorpromazina, registrando una diminuzione dell’accumulo di g7-NP nei neuroni ippocampali. Al contrario, il blocco dell’endocitosi caveolina-dipendente mediante l’iniezione di staurosporina non ha prodotto alcuna variazione nella distribuzione di g7-NP. Poichè le vescicole contenenti le g7-NP mostrano, in vitro, le caratteristiche di endosomi precoci Rab5 positivi derivanti da vescicole di clatrina e sono negative per il marker caveolare EEA1 abbiamo verificato in vivo lo stesso fenomeno confermando un’impressionante colocalizzazione di g7-NP con Rab5 e non con EEA1 negli interneuroni ippocampali.
I risultati dimostrano che le g7-NP attraversano la BEE, sono endocitate mediante meccanismo clatrina dipendente e si accumulano in endosomi Rab5 positivi in specifici tipi neuronali e microgliali.

The development of nanotechnologies and the synthesis of non-toxic, biodegradable and biocompatible polymeric chemicals have led to the creation of "synthetic", non invasive, drug delivery systems known as nanocarriers, directed to different parts of the body including the brain. The PolyLactideCoGlycolide (PLGA) is the most important synthetic polymer developed for the formulation of nanoparticles (NPs) whose use as drug delivery system has been approved for parenteral administration by the European Medicines Agency, reducing the time for the clinical applicability in humans. Before the "smart drug carriers" use would be extended to the neurological field, distribution and interaction within the central nervous system (CNS) cells must be assessed accurately. The purpose of the present work is to study the in vivo biodistribution of PLGA-NPs, modified with g7 (g7-NPs), a glycopeptide that allows the passage of the blood-brain barrier (BBB ), the interaction with CNS cells and the mechanism of transport between cells. After physico-chemical characterization, g7-NPs were injected intraperitoneally (i.p.) in C57BL6 mice. Using confocal microscopy, we identified specific brain areas and cells that accumulate g7-NPs. Six hours after the i.p. injection, g7-NPs were distributed heterogeneously within the brain, in the gray matter as well as in the white matter. Among the positive areas to g7-NPs accumulation, we analyzed the hippocampal region, revealing that the majority of cells positive to g7-NPs were NeuN positive neurons and microglial Iba1 positive cells, while only rarely, the g7-NPs were located in GFAP positive astrocytes. While the distribution in the cell types did not change over time (from 10 minutes to 5 days), g7-NPs accumulation shows a peak at 30 minutes, decreased over time and then remain stable up to 5 days after i.p. administration. To investigate the mechanism of g7-NP uptake in vivo within the brain, according to in vitro data, the clathrin-dependent endocytosis was selectively inhibited in the hippocampus of mice by intracerebral injection of chlorpromazine, revealing a decrease of g7-NPs accumulation in hippocampal neurons. In contrast, the injection of staurosporine, to block caveolin-dependent endocytosis, did not produce changes in the distribution of g7-NPs. Furthermore, since in vitro data suggested that g7-NP positive vesicles were like early endosomes positive for Rab5, a clathrin derived vesicle marker, and negative for the caveolar EEA1 marker, we studied the same phenomenon in vivo, confirming the impressive colocalization of g7-NPs with Rab5 and not with EEA1 within ippocampal neurons. These results demonstrate that g7-NPs cross the BBB, are endocytosed through clathrin-dependent mechanism and accumulate in specific neurons and microglia within Rab5 positive endosomes.