Riassunto analitico
Lo scopo della mia tesi è studiare l’interazione tra la timidilato sintasi umana (hTS) e il suo mRNA, che caratterizza il suo meccanismo di autoregolazione trascrizionale a feedback negativo sulla produzione di hTS stessa. Per cercare di capire come avvenga questo legame a livello cellulare utilizziamo una tecnica biofisica a single molecule chiamata optical tweezer. Questa tecnica prevede la sintesi del binding site 1 dell’mRNA di hTS e il suo ancoraggio a due biglie tramite interazioni specifiche di biotina-streptavidina e digoxigenina-anticorpo. Le due biglie all’interno del sistema sono posizionate in un laser ottico che ne consente lo spostamento, tramite l’applicazione di una forza meccanica. L’energia meccanica e lo spostamento delle biglie tra loro provoca uno streaching del nostro costrutto determinando un unfolding della struttura secondaria “hairpin” che caratterizza il binding site 1 di TS. Tramite questa tecnica possono essere studiate quindi le energie conformazionali del costrutto e successivamente il binding a esso della proteina. Questo permetterà di ottenere informazioni sul tipo di legame e sul meccanismo di repressione translazionale, di avere un sistema per testare quale forma della proteina sia responsabile di questa regolazione (forma attiva, inattiva, monomerica o dimerica). In più consentirà di capire il ruolo di nuove molecole inibitori della timidilato sintasi sulla sua funzione regolatoria per cercare di oltrepassare il consueto meccanismo di resistenza che la proteina attiva in presenza di antitumorali classici. La timidilato sintasi è una proteina omodimerica che rappresenta un target noto e validato per la terapia contro il cancro in quanto è un enzima chiave coinvolto nel ciclo dei folati, essenziale per la replicazione e riparazione del DNA. L’utilizzo degli inibitori classici di hTS in cellule di carcinoma colon-rettale porta all’insorgenza di meccanismi di farmaco resistenza. Le cellule che presentano un’aumentata attività di hTS risultano meno sensibili ai farmaci che bloccano la stessa proteina, come il 5FU e il pemetrexed, e dimostrano cross-resistenza verso altri chemioterapici come l’oxaliplatino. Per questa ragione sono stati proposti dei nuovi inibitori con un meccanismo d’azione che prevede come target l’interfaccia del dimero della proteina portandola così dalla forma dimerica a quella monomerica (dimer destabilizers, DDIS). Questo nuovo approccio terapeutico previene l’overespressione di hTS e aumenta la sua degradazione tramite proteosoma. È stato dimostrato che dopo la somministrazione di DDIS, sia in vitro che in vivo, l’attività catalitica di hTS è inibita e la sua concentrazione diminuisce a causa della dissociazione del dimero. La timidilato sintasi, oltre a inibire la sua trascrizione tramite legame con il suo mRNA, interagisce con altri RNA messaggeri regolando l’espressione di numerosi geni tra cui quelli che regolano l’apoptosi e la chemiosensibilità (c-myc, blc-2, p53). hTS è in grado di espletare questo meccanismo di autoregolazione trascrizionale nel momento in cui ha il sito attivo libero da ligandi; al contrario quando questo è occupato sia dai suoi substrati fisiologici, sia dagli inibitori, la sua capacità di legare il suo stesso mRNA è ridotta in vitro. Con lo scopo di studiare l’effettiva struttura e conformazione dell’mRNA di hTS contenente il dominio di legame della proteina (binding site 1, BS1), abbiamo sintetizzato un costrutto di RNA con il BS1 la cui struttura è stata predetta tramite software UNAfold. I risultati computazionali suggeriscono una struttura a hairpin con 3 possibili configurazioni. L’effettiva conformazione del costrutto è stata analizzata all’optical tweezer.
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Abstract
The aim of my thesis is to study the interaction between human Thymidylate Synthase (hTS) and its mRNA. HTS with this interaction is able to control its own biosynthesis with a negative feedback mechanism. With the purpose to study this mechanism in cell we prepare a single molecule experiment call Optical Tweezers (OT). First of all we synthesized a truncated domain of TS mRNA binding site 1 fixed into the optical trap with specific bounding with beads functionalised with biotin-streptavidin and digoxigenin-anti-dig. The beads in the optical trap exert a force on the construct causing a streatching and a unfolding of the secondary structure of the hairpin, that is typical of hTS BS1. With this technique we can study the energies the associated with mRNA actual folding and consequently, by adding a stoichiometric amount of recombinant hTS, we will reveal the actual regions of mRNA interactions with the protein. This will provide to understand the translational repressor’s activity of the protein and characterized which form of hTS is important to interact with its mRNA between active/inactive or monomeric/dimeric conformation. Then we can understand a new approach with inibhitors that will down-regulate the protein to overcome the chemoresistance give by the classical inibhitors. Human Thymidylate Synthase (hTS) is a critical target for cancer therapy, as it is the key enzyme of folate cycle for DNA replication and repair. However, drug resistance in colorectal cancer (CRC) cells leads to chemoresistance mechanism. Cells with increased TS protein activity are less sensitive to TS-targeting chemotherapeutic agents (5-FU and pemetrexed), and exhibit cross-resistance to other chemotherapeutics (e.g., oxaliplatin). For this reason, we have recently proposed innovative hTS inhibitors with an innovative mechanism of action that prevent protein overexpression and downregulate hTS by increasing its proteasomal degradation rate, by targeting the dimer interface and drive the dimer to separate into its monomers (dimer destabilizers, DDIS). We have demonstrated that after the administration of DDIS, both in vitro and in vivo, hTS catalytic activity is inhibited, and the intracellular protein level is rapidly decreased because of TS dimer dissociation. HTS is also assumed to regulate cellular expression of several genes, including those regulating apoptosis and chemosensitivity (c-myc, blc-2, p53) by bounding their mRNA. The state of ligand occupancy influences hTS's RNA-binding activity. When hTS is devoid of active-site ligands, its RNA-binding activity is at its peak, resulting in translational repression of TSmRNA. When hTS is bound to either of its physiologic substrates or substrate-analogue inhibitors, the in vitro binding of TS to its mRNA is reduced. For this purpose, we have synthesized a truncated domain of TS mRNA binding site 1, whose structure folding was predicted with UNAFold.) The computational results suggest the formation of a hairpin structure with three possible configurations. The construct is then analysed with optical tweezer.
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