• 3D Cultures
• ALDH
• Cancer Stem Cells
• Mesothelioma
• TRAIL

Background. Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore aggressivo che deriva dalle cellule mesoteliali della pleura a seguito dell’esposizione all’amianto. In Italia, tra il 1993 e il 2008, il tasso di incidenza standardizzato per età è stato doppio (0.80) rispetto al valore mondiale (0.39) e si prevede che cresca nei prossimi 15 anni. Il MPM viene solitamente diagnosticato in stadi avanzati e la resezione chirurgica è possibile solo in una minoranza di pazienti. I regimi chemioterapici standard con pemetrexed più/meno composti del platino raggiungono una sopravvivenza globale mediana di 12 mesi e solo il 7% dei pazienti sopravvive a 5 anni dalla diagnosi. Diversi studi hanno evidenziato il ruolo cruciale svolto dalle cellule staminali tumorali (CSC) nella chemioresistenza e nella recidiva tumorale in diverse neoplasie, incluso il MPM, e molti tentativi sono stati fatti per sviluppare nuove terapie mirate alle CSC. TRAIL (da “Tumour necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand”) è una molecola antitumorale promettente grazie alla sua capacità di indurre selettivamente l’apoptosi nelle cellule tumorali, risparmiando il tessuto sano. Sebbene molti studi abbiano dimostrato che le CSC di diversi tumori mostrano un’elevata resistenza all’effetto apoptotico di TRAIL, l’efficacia delle terapie basate su TRAIL nel bersagliare le CSC di MPM rimane inesplorata. Pertanto, in questo studio abbiamo identificato, isolato e caratterizzato le CSC di MPM con l’obiettivo di studiare, per la prima volta, la loro sensibilità all’apoptosi indotta da TRAIL rispetto alla popolazione parentale.
Risultati. Le linee cellulari di MPM (MSTO-211H; NCI-H28; NCI-H2052; NCI-H2452; ZL34) hanno mostrato un’ampia variabilità nella percentuale di cellule ALDHbright. Concentrandoci sulla linea cellulare MSTO-211H sensibile a TRAIL, l’utilizzo di un mezzo di coltura selettivo ci ha permesso di generare delle tumorosfere (MSTO-211H TMS ) robuste e a rapida crescita in vitro. Le MSTO-211H TMS hanno mostrato un arricchimento in cellule ALDHbright. Le analisi di RT-qPCR hanno rivelato un’aumentata espressione di geni correlati alla staminalità, come Sox-2 e Oct-4, nelle MSTO-211H TMS. L’espressione in membrana dei recettori funzionali (DR4; DR5) e non funzionali (DcR1; DcR2) di TRAIL è stata studiata mediante analisi FACS, osservando un’espressione più che raddoppiata di DcR2 ed una maggiore MFI di DR5 nelle MSTO-211H TMS rispetto alle cellule parentali. Le cellule MSTO-211H ALDHbright isolate tramite sorting hanno mostrato una lieve ma significativa sovraespressione di Oct-4 rispetto alla popolazione ALDHdim. Sono stati eseguiti saggi dose-risposta in vitro con TRAIL solubile (sTRAIL) per valutare l’impatto citotossico di sTRAIL su MSTO-211H TMS e MSTO-211H ALDHbright isolate tramite sorting. In particolare, la sensibilità a sTRAIL non è risultata drammaticamente diversa tra MSTO-211H TMS e MSTO-211H ALDHbright isolate, ed entrambe le popolazioni hanno mostrato un’elevata resistenza all’apoptosi rispetto alla linea parentale. Sono state generate delle co-colture 3D di cellule staminali/stromali mesenchimali di derivazione adiposa modificate per l’espressione di sTRAIL (AD-MSC sTRAIL) con MSTO-211H parentali o MSTO-211H TMS: mentre le prime si sono mostrate marcatamente sensibili alle AD-MSC sTRAIL, le seconde sono risultate solo in parte suscettibili. Infine, le analisi di RT-qPCR hanno suggerito il ruolo chiave di cFLIP e, in particolare, di Bcl-xL come mediatori della resistenza a sTRAIL nelle CSC da MPM.
Conclusioni. I nostri studi hanno evidenziato il ruolo delle CSC nella resistenza del MPM alle terapie basate su TRAIL, identificando i meccanismi molecolari coinvolti nella sopravvivenza delle CSC e suggerendo possibili bersagli verso cui sviluppare approcci combinatori basati su TRAIL che possano sensibilizzare le CSC e portare ad un’efficace eradicazione del tumore.

Background: Malignant Pleural Mesothelioma (MPM) is an aggressive and deadly tumor arising from mesothelial cells of the pleura as a result of asbestos exposure. In Italy, between 1993–2008, the age-standardized incidence rate was double (0.80) than the world value (0.39), and it is expected to grow in the next 15 years. MPM is usually diagnosed in advanced stages and surgical resection is possible only in a minority of patients. Standard chemotherapy regimens with pemetrexed plus/minus platinum achieve a median overall survival of 12 months and only 7% of patients survive at 5 years from the diagnosis. Several studies have highlighted the crucial role played by Cancer Stem Cells (CSCs) in chemoresistance and tumor relapse in cancers, including MPM, and many attempts have been made with the intent of developing novel CSC-targeted therapies. Tumour necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) is a promising anti-tumor molecule due to its ability to selectively induce apoptosis in cancer cells, while sparing healthy tissue. Although many studies have demonstrated that CSCs from different tumors show a high resistance to TRAIL apoptotic impact, the efficacy of TRAIL-based therapies in targeting MPM CSCs remains unexplored. Therefore, in this study we intended to identify, isolate, and characterize putative CSCs in MPM aiming to investigate, for the first time, their sensitivity to TRAIL-induced apoptosis compared with the parental population. Results: MPM cell lines (MSTO-211H; NCI-H28; NCI-H2052; NCI-H2452; ZL34) displayed a wide variability in the amount of ALDHbright cells. Focusing on the TRAIL-sensitive MSTO-211H cell line, the use of a selective culture medium allowed us to establish robust and fast-growing tumorspheres (TMS) in vitro. MSTO-211H TMS showed an enrichment in ALDHbright cells compared with parental MSTO-211H. RT-qPCR analyses revealed an up-regulated expression of stemness-related genes, such as Sox-2 and Oct-4, in MSTO-211H TMS. The membrane expression of functional (DR4; DR5) and decoy (DcR1; DcR2) TRAIL receptors was investigated by FACS analysis on both parental MSTO-211H and MSTO-211H TMS, observing a more than double expression of DcR2 and a higher mean fluorescence intensity of DR5 in MSTO-211H TMS. ALDHbright sorted MSTO-211H cells displayed a slight but significant up-regulation in Oct-4 expression compared with the ALDHdim population. In vitro dose-response assays with soluble (s)TRAIL were performed to assess the impact of sTRAIL-mediated cytotoxicity on MSTO-211H TMS and ALDHbright sorted MSTO-211H. Notably, the sensitivity to sTRAIL was not dramatically different between MSTO-211H TMS and ALDHbright sorted MSTO-211H, and both exhibited a high resistance to apoptosis compared with parental MSTO-211H. Three-dimensional (3D) co-cultures of sTRAIL-armed Adipose-Derived Mesenchymal Stem/Stromal cells (AD-MSC sTRAIL) with parental MSTO-211H or MSTO-211H TMS were established: while the former were markedly sensitive to AD-MSC sTRAIL, the latter were only mildly affected. Finally, RT-qPCR analyses suggested the key role of cFLIP and, especially, Bcl-xL as drivers of sTRAIL resistance in putative CSC from MPM cells. Conclusions: Our findings shed light on the role of CSCs in MPM resistance to TRAIL-based therapies, indicating the molecular mechanisms involved in CSC survival and suggesting possible druggable targets to develop combinatorial TRAIL-based approaches that might sensitize CSCs and lead to an effective tumor eradication.