• caseina
• CEP
• Lacticaseibacillus
• Peptidi biottivi
• sistema proteolitico

Negli ultimi due decenni numerosi studi scientifici hanno evidenziato gli effetti positivi sulla salute dei peptidi bioattivi (BP) presenti nelle matrici alimentari, in particolare nei prodotti lattiero-caseari. I peptidi bioattivi possiedono funzionalità biologiche molto importanti, come attività antimicrobiche, antipertensive, antiossidanti, anticitotossiche e immunomodulatorie. Le caseine del latte sono considerate la fonte più importante di BP e devono essere idrolizzate in piccoli peptidi per esercitare effetti positivi sul sistema fisiologico umano. I batteri lattici (LAB) utilizzano le proteine del latte come fonte primaria di amminoacidi essenziali e sono considerati i principali responsabili del rilascio di BP nel latte. Sia i batteri starter (S-LAB) che quelli non starter (NS-LAB) possono rilasciare BP nei prodotti lattiero-caseari fermentati. Nei loro sistemi proteolitici, le proteinasi associate alla parete (CEP) sono responsabili della prima fase dell'idrolisi della caseina e svolgono un ruolo chiave nella produzione di BP.
In questo studio, ci siamo concentrati sulla caratterizzazione biochimica e genetica di CEP derivanti da tre ceppi NSLAB precedentemente isolati da Parmigiano Reggiano stagionato e selezionati per la loro elevata attività proteolitica e attitudine a rilasciare BP, come Lacticaseibacillus rhamnosus 0503 e Lacticaseibacillus casei PRA205 e 2006. Dopo l'induzione delle CEP in un terreno arricchito con proteine del latte ma senza amminoacidi, le CEP sono state estratte utilizzando un tampone privo di Ca2+ e negli estratti enzimatici grezzi risultanti sono state determinate la concentrazione proteica e l'attività proteolitica contro un substrato specifico cromogenico. Sono stati determinati gli effetti della temperatura, del pH, degli ioni metallici e degli inibitori sull'attività delle CEP. Tutti le proteinasi hanno mostrato l’attività proteolitica più alta a pH 7,5, mentre la temperatura ottimale era di 40°C. L'attività proteolitica di tutte le CEP è stata quasi completamente inibita dal PMSF (fenilmetilsolfonil fluoruro), un inibitore della serina proteinasi, suggerendo che le CEP appartenessero alla famiglia delle serin proteasi. L'attività caseinolitica contro αs1- e β-caseina è stata studiata sia con SDS-PAGE che con esperimenti UHPLC-MS/MS. I BP sono stati identificati utilizzando il Milk Bioactive Peptide Database (MBPDB). È stato studiato anche il pattern dei geni prt codificanti le CEP in L. casei PRA205, L. casei 2006 e L. rhamnosus 0503. La ricerca blast contro gli i genomi assemblati disponibili in GenBank ha mostrato che nei genomi di L. casei potrebbero essere presenti due geni prtP divergenti (vale a dire cas_prtP1, cas_prtP2) e tre prtR (vale a dire cas_prtR1, cas_prtR2 e cas_prtR3), mentre L. rhamnosus potrebbe possedere prtP (rham_prtP) o prtR (rham_prtP) o, in alcuni casi, entrambi. Gli allineamenti di sequenze hanno consentito l'identificazione di regioni conservate all'interno o attorno ai domini catalitici di ciascun tipo di geni prt. Queste regioni sono state utilizzate come target per la progettazione di sette coppie di primer specifici del tipo di prt che sono state testate nei test PCR. Il sequenziamento degli ampliconi PCR risultanti ha mostrato che i ceppi PRA205 e 2006 possiedono sia cas_prtP2 che cas_prtRprtR1, una combinazione di geni insolita per L. casei. Allo stesso modo, L. rhamnosus 0503 ha entrambi i geni rham_prtP e rham_prtP. Questo studio permette la caratterizzazione delle CEP in un gruppo di LAB scarsamente studiato, come i NSLAB. Abbiamo dimostrato che L. casei PRA205 e 2006 hanno una peculiare composizione genetica con due differenti geni prt. I risultati suggeriscono anche che le CEP derivati da L. casei PRA205 sono più attive a pH e temperatura bassi rispetto agli altri ceppi. Questa caratteristica potrebbe contribuire positivamente alla produzione di latticini fermentati arricchiti in BP, come latte fermentato e yogurt.

In the last two decades an increasing number of scientific evidences supports the beneficial health effects of bioactive peptides (BPs) in food matrices, especially in food dairy products. Bioactive peptides possess very important biological functionalities, such as antimicrobial, antihypertensive, antioxidative, anticytotoxic, and immunomodulatory activities. Milk caseins are considered the most important source of BPs and they need to be hydrolysed into small peptides to exert positive effects on the human physiological system. Lactic acid bacteria (LAB) utilise milk proteins as primary source of essential amino acids and are considered the main responsible for the release of BPs in milk. Both starter (S-LAB) and non-starter (NS-LAB) bacteria can release BPs in fermented dairy products. In their proteolytic systems, cell envelope-associated proteinases (CEPs) are responsible of the first step of casein hydrolysis and play a key role in BPs production. CEPs from SLAB have been extensively investigated, while poor information is available about CEPs from NSLAB. In this study, we focused on the biochemical and genetic characterization of CEPs from three NSLAB strains previously isolated from ripened Parmigiano Reggiano cheese and selected for their high proteolytic activity and aptitude to release BPs, such as Lacticaseibacillus rhamnosus 0503 and Lacticaseibacillus casei PRA205 and 2006. After CEP induction in medium enriched in milk proteins but from amino acids-free, CEPs were extracted by using Ca2+-free buffer and protein concentration and proteolytic activity against the specific substrate succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanine-p-nitroanilide were determined in the resulting crude enzyme extracts. The effects of temperature, pH, metal ions and inhibitors on CEP activity were determined. All the CEPs displayed the highest proteolytic activity at pH 7.5, while the optimal temperature was 40°C. The proteolytic activity displayed by all the CEPs was almost completely abolished by PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), a serine proteinase inhibitor, suggesting that the CEPs were a member of the serine proteinases family. The caseinolytic activity against αs1- and β-casein was investigated both with SDS-PAGE and with UHPLC-MS/MS experiments. β-casein was the preferential substrate over αs1-casein, suggesting that the CEPs belong to PI/PIII type. BPs were identified using the Milk Bioactive Peptide Database (MBPDB). The pattern of CEP-encoding prt genes in L. casei PRA205, L. casei 2006 and L. rhamnosus 0503 was also investigated. Blast search against genome assemblies available in GenBank showed that in L. casei genomes two divergent prtP (namely cas_prtP1, cas_prtP2) and three divergent prtR (namely cas_prtR1, cas_prtR2, and cas_prtR3) genes could be present, while L. rhamnosus could possess either prtP (rham_prtP) or prtR (rham_prtP) or, in a few cases, both of them. Sequences alignments allowed for the identification of conserved regions within or surrounding the catalytic domains of each type of prt genes. These regions were used as targets for designing seven prt type-specific primer pairs that were tested in PCR assays. Sequencing of the resulting PCR amplicons showed that strains PRA205 and 2006 possess both cas_prtP2 and cas_prtR1, a gene combination unusual for L. casei. Similarly, L. rhamnosus 0503 has both rham_prtP and rham_prtP genes. Overall, this study contributes to increase the genetic and biochemical knowledge on CEPs in a poorly investigated group of LAB, such as the NSLAB. We proved that L. casei PRA205 and 2006 have a peculiar genetic make-up with two different prt genes. The results also suggest that CEPs derived from L. casei PRA205 are more active at low pH and temperature compared to the other strains. This trait could positively contribute to the production of fermented dairy foods enriched in BPs, such as fermented milk and yogurt.