Riassunto analitico
Il microbiota del formaggio influisce notevolmente sulle caratteristiche organolettiche del prodotto stesso e rappresenta un ecosistema complesso in cui batteri lattici (LAB), sia avventizi che starter, coesistono insieme a lieviti e, in alcuni casi, muffe. La maggior parte della letteratura si è concentrata sul contributo dei LAB alla definizione della qualità dei formaggi, lasciando pochissimo spazio ai lieviti, che per moltissimo tempo sono stati considerati solo come meri contaminanti dei prodotti lattiero-caseari. Recentemente numerose evidenze hanno dimostrato che anche questi microorganismi sono importanti per ottenere una corretta maturazione e stagionatura in diverse tipologie di prodotto. Nel caso del Parmigiano Reggiano, alcuni studi hanno indagato la presenza e la diversità dei lieviti nel siero innesto, utilizzato come starter lattico naturale per l’acidificazione del latte, mentre non sono disponibili informazioni sull'abbondanza e la distribuzione delle specie di lieviti lungo l'intera filiera di produzione. In questo lavoro abbiamo indagato il profilo della frazione coltivabile dei lieviti nella prima parte della catena produttiva del Parmigiano Reggiano, partendo dal latte fino al formaggio prima della salatura. I campioni sono stati raccolti in un caseificio del comprensorio di produzione del PR e includevano latte della sera, latte del mattino, siero innesto, latte in caldaia a fine acidificazione, cagliata e formaggio prima della salamoia. Per identificare sia i lieviti fermentanti che quelli non-fermentanti il lattosio, sono stati utilizzati i terreni YPDA e YPLA a due diverse condizioni di temperatura (30°C e 42°C). La popolazione di lieviti esaminata in YPD, presentava una notevole variabilità di crescita, con i valori più alti di 1.97*10^3 CFU/mL nel campione di forma, e quelli più bassi di 1.5*10^2 CFU/mL nel campione di siero innesto. La popolazione di lieviti in YPL, calcolata unicamente per il campione di siero innesto, presentava valori di 1.1*10^2 CFU/mL. Un totale di 41 isolati è stato sottoposto a estrazione del DNA genomico e analisi di fingerprinting mediante microsatellite-primed PCR (MSP-PCR) con il primer (GTG)5. I profili di fingerprinting genico sono stati convertiti in matrice di similarità mediante coefficiente di correlazione di Pearson e i pattern sono stati raggruppati mediante analisi di clustering UPGMA. Sono stati evidenziati 8 cluster e 19 ceppi singleton ad un threshold di similarità del 90%, suggerendo che esisteva una grande diversità genica fra gli isolati. L’attribuzione a livello di specie è stata condotta mediante analisi PCR RFLP con gli enzimi di restrizione HaeIII e HinfI della regione ribosomale comprendente lo spaziatore interno ITS1, il gene 5.8S rRNA e lo spaziatore interno ITS2. Su 41 isolati analizzati sono stata individuati 13 profili di restrizione. Un ceppo rappresentativo di ogni profilo PCR-RFLP è stato sottoposto a sequenziamento della regione D1/D2 del gene 26S rRNA per confermare l’attribuzione di specie.
|
Abstract
The cheese microbiota considerably impacts cheese organoleptic features and represents a complex ecosystem where both adventitious and starter lactic acid bacteria (LAB) coexist together with yeasts and, in some cases, moulds. Most of the literature focused on LAB, leaving very little space for yeasts, that have been considered for a very long time as only contaminants. Recently several evidences have shown that these microorganisms also significantly contribute to obtain a correct ripening and maturing in different types of cheese. In the case of Parmigiano Reggiano cheese, a few studies investigated yeast occurrence and diversity in natural whey starter, while no information are available on yeast species abundance through the entire production chain. In this work we investigated the profile of yeast cultivable fraction in the first part of the PR cheesemaking from milk to cheese before salting. Samples were collected in a PR cheese factory and included evening milk, morning milk, natural whey starter, milk in vat, curd, and cheese before brining. To identify both lactose-fermenting and lactose-nonfermenting yeasts, Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) and Yeast Extract Peptone Lactose (YPL) media were used at two different temperature conditions, namely 30°C and 42°C. The yeast population examined in YPD showed a remarkable variability of growth, with the highest values of 1.97*10^3 CFU/mL in pre salting cheese sample and the lowest ones in 1.5*10^2 CFU/mL in natural whey starter sample. Yeasts population in YPL was measured only for natural whey starter sample, showed values of 1.1*10^2 CFU/mL.
A pool of 41 isolates were submitted to genomic DNA extraction and genetic fingerprinting analysis using microsatellite-primed PCR assay with primer (GTG)5. Fingerprinting pattern comparison was converted into a similarity matrix using Pearson’s correlation coefficient and submitted to clustering analysis by UPGMA method. The dendrogram showed 8 clusters and 19 singleton strain using 90% as similarity cut-off. The data suggested a high degree of genetic diversity among yeasts isolated from different steps in PR cheese-making. To further investigate the degree of this diversity, species attribution was carried out through PCR-RFLP analysis of ribosomal region including 5.8S rRNA gene and the intervening upstream and downstream regions ITS1 and ITS2, respectively. Out of 41 isolates considered in this work, we identified 13 restriction profile, named from A to O. One strains representative of every PCR-RFLP restriction profile was submitted to Sanger sequencing of the variable D1/D2 domain within the 26S rRNA gene.
|