Riassunto analitico
Tra i membri della famiglia di proteine MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), MEF2C esercita un ruolo rilevante nella miogenesi cardiaca e scheletrica.
Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che oltre alla sua importanza per il differenziamento terminale del muscolo, MEF2C è coinvolto anche nella progressione del ciclo cellulare e nella proliferazione.
Questo fattore di trascrizione subisce infatti uno splicing alternativo e le due varianti di splicing contenenti i due esoni mutualmente esclusivi α1 e α2 influenzano in maniera differente la proliferazione e il differenziamento terminale dei progenitori muscolari.
In particolare, l'isoforma α2 è per lo più espressa nei mioblasti differenziati, mentre l'isoforma α1, che presenta i due siti accettori del gruppo fosfato Ser98 e Ser110, stimola la proliferazione dei mioblasti ed induce l'ipertrofia del muscolo scheletrico, mediata dalla pathway PI3K-AKT-S6K.
É stato osservato come anche in linee cellulari di Rhabdomyosarcoma, tumore pediatrico caratterizzato da cellule che continuano a replicarsi con un conseguente inefficiente differenziamento muscolare terminale, vi sia una maggiore espressione dell'isoforma α1.
I nostri dati indicano che MEF2Cα1 promuove la proliferazione delle cellule di RMS, reprime il differenziamento terminale ed attiva la pathway PI3K-AKT-S6K. Tuttavia, sembrerebbe che uno splicing alternativo aberrante non sia l'unico meccanismo responsible dell'inefficiente attività pro-miogenica di MEF2Cα1 nei mioblasti proliferanti. Ad esempio, i già menzionati siti accettori del gruppo fosfato sono siti di legame di PIN1, peptidil prolil cis-trans isomerasi che agisce come repressore del differenziamento muscolare.
Durante il mio lavoro di tesi abbiamo isolato quattro cloni della linea cellulare C2C12 che over esprimono MEF2Cα1, MEF2Cα2, MEF2Cα1 mutante nei due siti accettori del gruppo fosfato (2SA) e, come controllo, una linea clonale trasfettata con il vettore vuoto (RFP).
Successivamente abbiamo investigato i cambiamenti fenotipici, inclusi il potenziale proliferativo e differenziativo, connessi alle modifiche post trascrizionali (splicing) e post traduzionali (fosforilazione).
Abbiamo inoltre analizzato come le differenti isoforme di MEF2C e il loro stato di fosforilazione esercitino un diverso effetto sull'attivazione della pathway PI3K-AKT-S6K.
Ciò che è emerso è che l'over espressione di MEF2Cα1 e del mutante non fosforilabile 2SA sono in ugual modo in grado di stimolare la pathway PI3K-AKT-S6K sia nelle C2C12 che nelle cellule di RMS, MEF2Cα2, invece, non stimola questa pathway.
Inoltre, se nelle C2C12 MEF2Cα1 non reprime il differenziamento terminale ma, al contrario, lo promuove, nelle cellule di RMS è in grado di reprimerlo, mentre il mutante 2SA è in grado di stimolarlo, suggerendo come la fosforilazione giochi un ruolo fondamentale nel differenziamento muscolare.
Infatti, abbiamo notato che differentemente da quanto accade per le C2C12, nelle cellule di RMS la fosforilazione di MEF2Cα1 viene mantenuta anche dopo l'induzione del differenziamento muscolare e ciò potrebbe essere la causa della mancata uscita dal ciclo cellulare.
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Abstract
Among the members of Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2) family of proteins, MEF2C plays a remarkable role in cardiac and skeletal myogenesis.
In our laboratory it was demonstrated that beyond its well known importance for terminal muscle differentiation, MEF2C is also involved in cell cycle progression and proliferation.
Actually, this transcription factor undergoes extensive alternative splicing and the two splice variants containing the mutually exclusive exons α1 and α2 influence muscle progenitors proliferarion and terminal differentiation in distinct ways. Specifically, the α2 isoform is mostly expressed in differentiated myoblasts, whereas the α1 isoform, presenting the two phosphoacceptor sites Ser98 and Ser110, is a powerful stimulator of myoblast proliferation and an inducer of skeletal muscle hypertrophy mediated by the PI3K-AKT-S6K pathway.
Increased inclusion of the α1 exon in MEF2C transcripts was also observed in Rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines, a pediatric tumor characterized by cells that continue to replicate with a consequent ineffective muscle terminal differentiation.
Our data indicate that MEF2Cα1 promotes RMS cells proliferation, represses terminal differentiation and activates the PI3K-AKT-S6K pathway. However, we have evidence suggesting that aberrant alternative splicing of MEF2C is not the unique mechanism contibuting to the silencing of the pro-myogenic activity of MEF2Cα1 in proliferating myoblasts. For istance, the above mentioned two phosphoacceptor sites are binding sites for the peptidylprolyl cis-trans isomerase PIN1 that acts as a repressor of muscle differentiation.
During my work of thesis we have isolated four C2C12 cell clones stably over expressing the wild type version of MEF2Cα1, the wild type version of MEF2Cα2, the mutant on phosphoacceptor sites version of MEF2Cα1 (2SA) and, as control, a clone line transfected with an empty vector (RFP). We subsequently investigated the phenotypical changes, including the proliferative and differentiative potential, connected to the post transcriptional (splicing) and post transductional (phosphorilation) modifications. We further evaluated the influence of the different MEF2C isoform expression and of their state of phosphorylation on the PI3K-AKT-S6K pathway activation.
Our data indicate that over-expression of MEF2Cα1 and of its not phosphorylatable 2SA mutant are equally able to stimulate the PI3K-AKT-S6K pathway both in C2C12 and RMS cells, whereas the MEF2Cα2 splice variant does not stimulate this pathway. Though MEF2Cα1 does not represses C2C12 muscle cells terminal differentiation but, on the contrary, it promotes the process, in RMS cells it represses terminal differentiation, whereas the 2SA mutant stimulates it, suggesting how phosphorylation plays a key role in muscle differentiation. Indeed, we found that, differently from what happens in C2C12 cells, in RMS cells MEF2Cα1 phosphorylation persists upon stimulation of muscle differentiation and might be responsible for ineffective cell cycle exit.
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