Riassunto analitico
La distrofia muscolare facio-scapolo-omerale (FSHD) è considerata un disturbo autosomico dominante. La maggioranza dei soggetti affetti da FSHD (FSHD1) portano un ridotto numero (≤10) di tandem-repeats D4Z4 da 3.3 kb su un allele in 4q35; il 5% del totale degli affetti (FSHD2) portano alleli D4Z4 con 11 o più repeats, come nella popolazione generale. Il modello di patogenesi per FSHD indica che l’array di repeats D4Z4 governa la conformazione cromatinica in 4q35 in modo che una riduzione di repeats D4Z4 porti ad over-espressione dei geni vicini. Coerentemente con questo modello, diversi studi dimostrarono che sia FSHD1 che FSHD2 sono caratterizzate da ridotta metilazione del DNA nell’array D4Z4. Circa l’80% dei pazienti FSHD2 portano in eterozigosi mutazioni nel gene SMCHD1 (structural maintenance of chromosomes flexible hinge domain containig-1), codificante per un regolatore epigenetico di specifici loci inclusi gli arrays D4Z4. È stato inoltre proposto che mutazioni nel gene SMCHD1 causano la comparsa della malattia in pazienti FSHD2 e si comportano come modificatori di malattia in FSHD1. La popolazione FSHD mostra una variabilità fenotipica clinica che non può essere spiegata né dalla dimensione degli alleli D4Z4, né dallo stato di ipometilazione D4Z4. Per descrivere tale variabilità, la Comprehensive Clinical Evaluation Form (CCEF) è utilizzata dall’Italian Clinical Network for FSHD per dividere i pazienti in diverse categorie cliniche in base alle caratteristiche fenotipiche del soggetto: soggetti con debolezza ai muscoli facciali e del giro scapolare tipici del FSHD sono categoria A; soggetti di categoria A presentanti anche segni atipici sono categoria D1; soggetti con fenotipi incompleti presentanti debolezza ai soli muscoli facciali o al solo giro scapolare sono categoria B; soggetti presentanti segni clinici di miopatia non consistenti con FSHD sono categoria D2; individui sani sono categoria C. Per investigare se variazioni in SMCHD1 contribuiscono alla variabilità fenotipica osservata, il gene SMCHD1 è stato analizzato nel nostro laboratorio con next generation sequencing (NGS) in 174 soggetti FSHD (143 FSHD1 e 31 FSHD2). L’analisi ha rilevato che 5 su 143 soggetti con allele ridotto (3.5 %) e 7 su 31 soggetti miopatici con alleli D4Z4 di normali dimensioni (23%) portano mutazioni nella sequenza codificante di SMCHD1. Tutte le mutazioni sono rare o nuove (minima frequenza allelica in database ExAC ≤0.000083). Per testare il significato dell’ipometilazione su D4Z4 e delle mutazioni in SMCHD1 nell’espressione dell’FSHD, abbiamo investigato questi parametri nei parenti dei casi indice portatori di mutazioni in SMCHD1. Il livello di metilazione D4Z4 e la sequenza del gene SMCHD1 sono stati studiati in 34 individui da 8 famiglie non correlate. Le varianti SMCHD1 evidenziate negli 8 casi indice (3 categoria A, 3 categoria B e 2 categoria D1) sono state trovate in 11 parenti su 8 famiglie. Abbiamo osservato vari fenotipi tra i parenti: 4 sono stati valutati come categoria B, 1 come categoria D1, 1 categoria D2 e 5 come categoria C. Su 19 individui portatori di varianti in SMCHD1, 11 (57.9%) mostrano ridotta metilazione del DNA in D4Z4 (RMD): 5 portatori di alleli D4Z4 ridotti (2 categoria D1, 1 categoria A, 2 categoria B) e 6 portatori di alleli D4Z4 di normale dimensione (1 categoria A, 3 categoria B, 1 categoria C, 1 categoria D2). Su 34 individui analizzati, 14 presentano fenotipo FSHD (3 categoria A, 8 categoria B e 3 categoria D1) e abbiamo osservato mutazioni in SMCHD1 insieme a RMD in 9 soggetti FSHD (5 FSHD1: 1 categoria A, 2 categoria B, 2 categoria D; 4 FSHD2: 1 categoria A, 3 categoria B). Abbiamo concluso che la compresenza di mutazioni in SMCHD1 e RMD non sono sufficienti a diagnosticare FSHD in portatori di array D4Z4 di normali dimensioni o a predire il decorso clinico in portatori di alleli ridotti.
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Abstract
Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is considered an autosomal dominant disorder. The majority of subjects affected by FSHD (FSHD1) carry a reduced number (≤10) of 3.3 kb tandemly arrayed D4Z4 repeats on one allele at 4q35; 5% of total affected individuals (FSHD2) carry D4Z4 alleles with 11 or more repeats, as in the general population. The current model explaining FSHD pathogenesis is that D4Z4 repeat array governs 4q35 chromatin conformation so that D4Z4 reduction leads to aberrant overexpression of nearby genes. Consistent with this model several studies showed that both FSHD1 and FSHD2 are characterized by reduced methylation of the D4Z4 array DNA. Roughly 80% of FSHD2 patients carry heterozygous dominant mutations in the SMCHD1 (structural maintenance of chromosomes flexible hinge domain containing-1) gene, encoding for an epigenetic regulator of specific loci including D4Z4 arrays. It has been thus proposed that mutations in SMCHD1 cause disease onset in FSHD2 patients and can act as a disease modifier in FSHD1. FSHD population shows clinical phenotypic variability that could not be explained neither by D4Z4 allele size, nor by the D4Z4 hypomethylation status. To describe the phenotypic variation, the new Comprehensive Clinical Evaluation Form (CCEF) is used by the Italian Clinical Network for FSHD to subdivide patients in different clinical categories based on the specific features of the subject’s phenotype: subjects presenting facial and scapular girdle muscle weakness typical of FSHD are classified as category A; category A subjects presenting additional atypical features are considered category D1; subjects presenting only facial or scapular weakness are described as clinical category B; subjects presenting clinical myopathic features not consistent with FSHD are assessed as category D2; healthy individuals are part of category C. To investigate whether SMCHD1 variations might contribute to the observed phenotypic variability, in our laboratory the SMCHD1 gene has been analyzed by next generation sequencing (NGS) in 174 subjects (143 carrying a reduced allele and 31 with alleles of normal size). This analysis revealed that 5 of the 143 subjects with reduced allele (3.5%) and 7 of the 31 myopathic subjects carrying D4Z4 alleles of normal size (23%) carry mutations in the SMCHD1 coding sequence. All mutations were rare or novel (minor allele frequency in ExAC database ≤0.000083). To test the significance of D4Z4 hypomethylation and SMCHD1 mutation in FSHD expression, we extended clinical and molecular analysis to families and investigated these parameters in the relatives of index cases carrying SMCHD1 variants. D4Z4 methylation level and SMCHD1 sequence were studied in 34 individuals from 8 unrelated families. The SMCHD1 variants found in 8 index cases (3 category A, 3 category B and 2 category D1) were detected in 11 relatives from 8 families. We observed various phenotypes among relatives: 4 were assessed as category B, 1 as category D1, 1 as category D2 and 5 as category C. Of 19 individuals carrying SMCHD1 variants, 11 (57.9%) displayed D4Z4 reduced DNA methylation (RDM): 5 carrying D4Z4 reduced allele (2 category D1, 1 category A, 2 category B) and 6 carrying D4Z4 allele of normal size (1 category A, 3 category B, 1 category C, 1 category D2). Out of 34 analyzed individuals (with Sanger sequencing and methylation analysis), 14 presented myopathic phenotypes (3 category A, 8 category B and 3 category D1). Overall, in the 8 families in which we were able to extend the analysis, we observed both SMCHD1 mutations and D4Z4 RDM in 9 FSHD subjects (5 FSHD1: 1 category A, 2 category B, 2 category D; 4 FSHD2: 1 category A, 3 category B). We thus concluded that the presence of both SMCHD1 mutation and RDM are not sufficient to diagnose FSHD in normal sized D4Z4 array carriers and to predict clinical severity in subjects a D4Z4 reduced allele.
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