Riassunto analitico
L’apparato respiratorio è uno dei distretti dell’organismo umano più predisposti alle malattie infiammatorie, nonostante la presenza di importanti meccanismi di difesa come le ciglia che rivestono le vie aeree e i macrofagi alveolari. L'attivazione dei macrofagi è correlata a varie patologie, come asma, BPCO, fibrosi cistica, tubercolosi, polmoniti, influenza e SARS-CoV-2. Lo sviluppo di trattamenti mirati ai macrofagi rappresenta una sfida a causa dell’azione di difesa svolta dalle ciglia, e i nanocarriers rappresentano una strategia utile per superare questo ostacolo. Le terapie anti-infiammatorie inalatorie disponibili comprendono principalmente i corticosteroidi, ma il loro uso prolungato può portare ad una significativa soppressione del sistema immunitario e conseguente aumento del rischio di infezioni. Pertanto, una terapia efficace ma priva di effetti immunosoppressori potrebbe rappresentare un’importante innovazione. In quest’ottica, è razionale proporre l’utilizzo per via inalatoria di una molecola lipidica endogena (LEm) che possiede un’azione anti-infiammatoria intrinseca.
Allo scopo di indirizzare questo composto ai macrofagi, sono stati progettati nanocarriers funzionalizzati con mannosio mediante l’utilizzo di molecole brevettate (UniMoRE, brevetto n. 102017000123886) che posseggono anche un’azione tensioattiva per la presenza di un acido grasso legato al mannosio, utile per la formulazione dei nanocarriers.
Il percorso per la sintesi delle due molecole funzionalizzanti (una con acido laurico e una con miristico) ha previsto: (i) la funzionalizzazione al carbonio anomerico del D-Mannosio peracetilato tramite acetalizzazione con N-Cbz-etanolammina; (ii) la deprotezione di Cbz tramite idrogenazione catalizzata da Pd per ottenere ammina libera; (iii) la reazione di acilazione del gruppo amminico libero con acido laurico o miristico; (iv) la deprotezione dei gruppi ossidrilici del mannosio tramite transesterificazione con NaOMe/MeOH, per ottenere le due molecole finali denominate Manno/Lau e Manno/Myr, quest’ultima usata nel presente lavoro.
Lo sviluppo dei nanocarriers è partito dalla formulazione di nanoparticelle convenzionali quali Solid Lipid Nanoparticles (SLN) a base di acido stearico dalle quali, riducendo progressivamente la quantità di eccipiente, si sono ottenuti nanodrugs a base unicamente di LEm e della molecola funzionalizzante (Manno/Myr). Il nanodrug cosi ottimizzato (nd_Manno/Myr) è stato confrontato con un sistema analogo preparato sostituendo Manno/Myr con un tensioattivo tradizionale (Sodio Taurocolato, ST) e con la LEm nativa. I quattro campioni (LEm-SLN, nd_Manno/Myr, nd_ST, e LEm nativa) sono stati caratterizzati dal punto di vista dimensionale con Photon Correlation Spectroscopy (PCS) e morfologico con microscopia elettronica a scansione (SEM). Inoltre, è stata determinata la dissoluzione di LEm tramite HPLC e della sua cristallinità mediante Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC). I quattro campioni, dopo liofilizzazione, sono stati caratterizzati
riguardo alla scorrevolezza, densità al versamento e all’impaccamento. Infine, per verificare la loro respirabilità, è stato impiegato il sistema Twin Glass Impinger.
I nanodrug systems ottenuti risultano avere dimensioni ottimali di circa 700 nm, e in forma di polvere secca, solo i sistemi nd_Manno/Myr risultavano possedere una frazione fine (Fine Particle Fraction), cioè potenzialmente capace di raggiungere gli alveoli, pari a circa l’80% della dose emessa. Questi risultati preliminari sono incoraggianti e pertanto la ricerca su questi sistemi verrà approfondita in studi futuri.
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Abstract
Despite the presence of important defense mechanisms such as cilia and alveolar macrophages, the respiratory system is one of the most predisposed districts of the human body to inflammatory diseases. Macrophage activation is associated with various pathologies, such as asthma, COPD, cystic fibrosis, tuberculosis, pneumonia, influenza, and SARS-CoV-2. The development of treatments targeted at macrophages poses a challenge due to the defensive action of cilia, and nanocarriers represent a useful strategy to overcome this obstacle. Current inhaled anti- inflammatory therapies mainly include corticosteroids, but their prolonged use can lead to significant suppression of the immune system and consequent increasing of the infection’s risk. Therefore, an effective therapy devoid of immunosuppressive effects could represent a therapeutic breakthrough. In this perspective, it is rational the proposal for the inhalation use of an endogenous lipid molecule (LEm) with an intrinsic anti-inflammatory action.
In order to target this compound to macrophages, nanocarriers functionalized with mannose have been designed using patented molecules (UniMoRE, patent no. 102017000123886) which also possess surfactant action, useful for the formulation of nanocarriers, due to the presence of a fatty acid linked to mannose. The synthesis pathway for the two functionalizing molecules (one with lauric acid and one with myristic acid) involved: (i) functionalization at the anomeric position of peracetylated D-mannose by acetalization with N-Cbz-ethanolamine; (ii) deprotection of Cbz by catalytic hydrogenation with Pd to obtain free amine; (iii) acylation of the free amino group with lauric or myristic acid; (iv) deprotection of Mannose hydroxyls by transesterification reaction with methanol catalyzed by NaOMe to obtain the two final molecules named Manno/Lau and Manno/Myr, the latter used in the present work.
The development of nanocarriers started from the formulation of conventional nanoparticles such as Solid Lipid Nanoparticles (SLN) based on stearic acid, from which, by progressively reducing the amount of excipient, nanodrugs (nd) based solely on LEm and the functionalizing molecule were obtained. The optimized nanodrug was compared with a similar system prepared by replacing Manno/Myr with a traditional surfactant (Sodium Taurocholate, ST) and with native LEm. The four samples (LEm-SLN, nd_Manno/Myr, nd_ST and native LEm) were characterized dimensionally by Photon Correlation Spectroscopy (PCS) and morphologically by scanning electron microscopy (SEM). Furthermore, the dissolution of LEm was determined by HPLC and its crystallinity by Differential Scanning Calorimetry (DSC). The four samples, after lyophilization, were characterized regarding flowability, bulk and tapped density. Finally, the Twin Glass Impinger system was employed to verify their respirability.
The obtained nanodrug systems have optimal sizes of approximately 700 nm, and in dry powder form, only the nd_Manno/Myr systems were found to possess a Fine Particle Fraction, potentially capable of reaching the alveoli, equal to approximately 80% of the emitted dose. These preliminary results are encouraging, and therefore, these systems will be further investigated in future studies.
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