Riassunto analitico
L’obbiettivo di questo lavoro di ricerca consiste nell’esprimere, isolare e testare l’efficacia di una LPMO ricombinante (Pp AA10 PMO) ottenuta da un costrutto genico inserito all’interno del cloroplasto di Chlamydomonas reinhardtii.
L’espressione di enzimi ricombinanti all’interno delle microalghe è un campo di ricerca alle prime fasi di studio, per questo lavoro è stato realizzata una metodica per la purificazione e la successiva validazione dell’attività dell’enzima.
Il primo step prevede la sonicazione della biomassa algale, seguita da una precipitazione delle molecole e delle componenti cellulari poco solubili tramite solfato di ammonio.
Il surnatante è fatto correre in due colonne per la purificazione, in successione una DEAE ed una SEC.
Infine, isolati e concentrati i prelievi contenenti la proteina d’interesse, ne è stata testata l’attività attraverso un saggio ATR-FT-IR, che permette la detection dell’attività enzimatica della Pp AA 10 PMO su un substrato specifico, la chitina.
Perché questo metodo risulti attendibile, quindi replicabile, i risultati sono stati comparati con altri metodi già affermati per l’identificazione. I metodi “golden standard” per la caratterizzazione delle proteine, utilizzati come confronto come la spettrometria di massa.
Infine, per caratterizzare i prodotti della reazione enzimatica, sono stati confrontati gli spettri ottenuti dal saggio ATR-FT-IR con soluzioni standard di oligomeri di NAG, sia mediante spettroscopia IR che tramite spettrometria di massa.
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