Riassunto analitico
L’albero biliare è costituito da cellule epiteliali, i colangiociti, ed è suddiviso in dotti biliari intra ed extraepatici, che fungono da condotti di trasporto della bile nell’intestino. L’alterazione della normale funzione dei colangiociti può portare allo sviluppo di patologie biliari chiamate colangiopatie, tra cui le più note sono le colangiti biliare e sclerosante primitiva. Si tratta di patologie rare a eziologia non ancora del tutto chiara: alcune evidenze dimostrano che il danno alle vie biliari possa essere causato da una disfunzione del sistema immunitario provocata da un agente tossico o da un evento infettivo, in individui geneticamente predisposti. Entrambe le colangiopatie condividono meccanismi fisiopatologici simili, tra cui colestasi, proliferazione cellulare, infiammazione, fibrogenesi e infine carcinogenesi. Ruolo centrale nelle colangiopatie lo svolge il pathway del TLR4, che stimolato da prodotti microbici porta al rilascio di citochine come IL-6 con l’effetto infiammatorio, e aumenta l’espressione del ligando di PD-1 (PD-L1) favorendo la proliferazione cellulare e il mantenimento della tolleranza immunitaria. Il progetto di tesi ha lo scopo di studiare gli effetti dell’attivazione del pathway di TLR4 sui colangiociti quando esposti ad un microambiente infiammatorio, al fine di chiarirne il ruolo nelle colangiopatie. Gli esperimenti sono stati condotti su una linea immortalizzata di colangiociti (H69) posta in co-coltura indiretta per 48 ore con cellule mononucleate del sangue periferico attivate (aPBMCs), allo scopo di mimare il microambiente infiammatorio. Inoltre, prima della co-coltura, le cellule H69 sono state stimolate con lipopolisaccaride (LPS) per 7 giorni per simulare l’infezione e attivare il pathway di TLR4. I dati di real time PCR e western blotting hanno evidenziato come i colangiociti siano in grado di down-regolare il recettore TLR4 e up-regolare PD-L1, IL-6, IFN-γ e TNF-α, in presenza di aPBMCs. Inoltre, il microambiente infiammatorio rende i colangiociti più proliferanti, portando ad una riduzione dei livelli proteici di marker di senescenza e apoptosi (p53, p21 e p16). In aggiunta a questo, è stato osservato che, in seguito a co-coltura, nelle aPBMCs si verifica un calo dei livelli di mRNA di citochine proinfiammatorie (IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-6), suggerendo meccanismi immunomodulatori compensatori promossi dai colangiociti. Infine, ci si è focalizzati sul ruolo dei colangiociti nel processo fibrotico delle colangiopatie a seguito dell’attivazione del pathway di TLR4 mediato da LPS. Indagini di microscopia confocale hanno evidenziato come il sistema in vitro di co-coltura indiretta tra H69 e aPBMCs sia in grado di mimare il microambiente infiammatorio, promuovendo nei colangiociti una transizione epitelio-mesenchimale, a seguito di riarrangiamenti citoscheletrici, responsabile di meccanismi patogenetici intracellulari con ruolo chiave nell'insorgenza e progressione delle colangiopatie. Questo progetto è solo in una fase iniziale di sviluppo. I risultati ottenuti, infatti, aprono la strada a futuri approfondimenti sulle condizioni e tempistiche di attivazione dei pathways di TLR4, IL-6/JAK/STAT3 e check-point immunomodulatori (PD-1/PD-L1), nonché sul loro cross-talk, con lo scopo di indagare i meccanismi patofisiologici e molecolari coinvolti nella cascata del danno epatico che possano fornire la base di nuovi approcci terapeutici per le colangiopatie.
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