Riassunto analitico
I policosanoli (PCs) sono una miscela di alcoli alifatici a lunga catena compresa tra i 22 e 34 atomi di carbonio. Sono presenti in una grande varietà di matrici naturali, e la loro composizione dipende dallo specifico materiale di origine, tra i quali i più utilizzati sono la canna da zucchero, la crusca di riso e il grano. A causa delle loro molteplici attività biologiche, l’interesse per questi composti sta recentemente crescendo. Infatti, i PCs sono noti soprattutto per il loro effetto di riduzione dei livelli sierici di colesterolo e lipidi, dovuto alla modulazione genica della HMG-CoA reduttasi. Inoltre, molte altre proprietà sono descritte in letteratura, tra cui l’attività antiossidante, antinfiammatoria e antiproliferativa e così via. Alla luce di tutto ciò, l'obiettivo di questa tesi magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è lo sviluppo di un metodo altamente efficiente per l'estrazione, la purificazione e l'analisi dei policosanoli in diverse matrici naturali, nonché la valutazione in vitro delle loro attività biologiche. In questo progetto di ricerca, sono state studiate due fonti alternative di PCs, tra cui la cera d'api e il materiale ceroso ottenuto dall'estrazione con fluidi supercritici (SFE) di infiorescenze di Cannabis sativa L. (canapa). Una procedura assistita da microonde (MAE) è stata utilizzata per la transesterificazione e l'idrolisi dei composti di interesse dal materiale di partenza. La fase finale di purificazione è stata eseguita utilizzando una cromatografia liquida preparativa in fase normale. Inoltre, è stato sviluppato un nuovo metodo HPLC-ELSD per separare e quantificare in modo efficiente i PCs nelle miscele finali purificate. L'identità dei picchi è stata confermata mediante GC-MS in seguito a derivatizzazione. Utilizzando HPLC-ELSD, è stato possibile dimostrare che i PCs C24OH, C26OH, C28OH, C30OH e C32OH sono presenti nella miscela purificata dalla cera d'api, e di questi gli ultimi due sono i più abbondanti. D’altra parte, la caratterizzazione del prodotto purificato ottenuto dalla cera di canapa ha mostrato C26OH e C28OH come composti principali; sono stati rilevati anche PCs a catena dispari (ovvero C23OH, C25OH e C27OH). Infine, diversi saggi in vitro, (tra cui attività antiossidante, antinfiammatoria, antiproliferativa), effettuati in collaborazione con gruppi di ricerca dell'Università di Milano e dell'Università di Torino (Italia), hanno evidenziato un’interessante azione antinfiammatoria dei prodotti purificati. Attualmente sono in corso ulteriori studi per confermare questi dati. In conclusione, poiché i policosanoli si sono dimostrati promettenti composti nutraceutici, lo sviluppo di metodi efficaci per la loro estrazione e purificazione da fonti alternative è degno di nota in ambito farmaceutico.
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Abstract
Policosanols (PCs) refer to a mixture of aliphatic alcohols with a long carbon chain between 22 and 34 carbons. They are present in a wide variety of natural matrices, and their composition depends on the specific source material. The most used ones are sugar cane, rice bran and wheat. The interest in these compounds is recently growing, due to their multiple biological activities. Indeed, PCs are mostly known for their serum lipid and cholesterol-lowering effects, due to gene modulation of HMG-CoA reductase. In addition, many other properties are described in the literature, including antioxidant, anti-inflammatory and anti-proliferative activities and so on.
In the light of all the above, the aim of this master thesis in Medicinal Chemistry and Technology project is the development of a highly efficient method for the extraction, purification and analysis of PCs in different natural matrices as well as the in vitro evaluation of their biological activities. In this research project, two alternative sources were investigated, including beeswax and wax material obtained from supercritical-fluid extraction (SFE) from non-psychoactive Cannabis sativa L. inflorescences (hemp). A microwave-assisted (MAE) procedure was used for transesterification and hydrolysis of the compounds of interest from the starting material. The final purification step was performed using preparative liquid chromatography under normal phase conditions. Moreover, a new HPLC-ELSD method was developed to efficiently separate and quantify PCs in the final purified mixtures. Peak identity was confirmed by GC-MS after derivatization.
Using HPLC-ELSD, it was possible to demonstrate that C24OH, C26OH, C28OH, C30OH and C32OH PCs are present in the purified mixture from beeswax, with the last two being the most abundant ones. On the other hand, the purified product obtained from hemp wax was characterized by C26OH and C28OH as the main compounds; odd-chain PCs (i.e. C23OH, C25OH and C27OH) were also detected. Lastly, different in vitro assays (i.e. antioxidant, anti-inflammatory, antiproliferative), carried out in collaboration with research groups at the University of Milan and University of Turin (Italy), showed an interesting anti-inflammatory effect of the purified products. Further studies are currently ongoing to confirm these data.
In conclusion, since policosanols proved to be interesting nutraceutical compounds, the development of effective methods for their extraction and purification from alternative sources are noteworthy in the pharmaceutical context.
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