Riassunto analitico
Gli enzimi Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMO) sono metallo-enzimi scoperti recentemente in batteri, funghi e artropodi che, tramite un meccanismo ossidativo, sono in grado di degradare polisaccaridi recalcitranti, quali ad esempio chitina e cellulosa. Questi enzimi stanno diventando sempre più conosciuti e ricercati nei processi industriali e in bioraffineria, infatti è stata dimostrata la loro efficacia e la loro attività ausiliaria in cocktail enzimatici utilizzati per la degradazione delle biomasse lignocellulosiche. recentemente la ricerca in merito si è basata su studi di ricombinazione, espressione e purificazione di questi enzimi con l’utilizzo di cellule di E.coli e di lieviti come ospiti di espressione. Con l’aumento della richiesta, l’attenzione degli studi si è focalizzata su nuove soluzioni coinvolgendo nuovi candidati per l’espressione genetica, ossia le alghe ed in particolare l’alga verde Chlamydomonas reinhardtii. Le alghe offrono notevoli vantaggi, rispetto ai sistemi utilizzati in precedenza e le loro caratteristiche (status GRAS, ricombinazione omologa e folding efficiente) le rendono applicabili con studio serrato, ad ogni ambito dell’industria, dall’ambito industriale appunto, al farmaceutico e medico. Un’applicazione interessante è l’espressione nei cloroplasti di queste alghe delle LPMO per ottenere in laboratorio protocolli rapidi ed efficienti di produzione su media e larga scala di queste proteine ricombinanti e purificate, e per superare i costi e le tempistiche delle applicazioni precedenti. In questo lavoro è stato utilizzato il ceppo algale Chlamydomonas reinhardtii TN72 mutato, ottenuto nei lavori di tesi precedenti e in grado di esprimere una forma di LPMO. Tramite approcci di microbiologia e crescita scalare, si sono ottenute informazioni precise sulla quantità specifica di biomassa algale da recuperare per riscontrare la presenza della proteina in quantità ragionevole. Sono poi state eseguite tecniche di indagine su gel SDS-PAGE e in WESTERN BLOT e la purificazione proteica (Cromatografia DEAE, AEX). Sono stati effettuati inoltre saggi enzimatici (Spettroscopia IR) per la verifica di efficacia su chitina della LPMO prodotta in C. reinhardtii, per confrontarli con i risultati ottenuti in precedenza da enzimi purificati da E.coli. La proteina ottenuta è state fatta agire in singolo ed in cocktails con altri enzimi ad attività ausiliaria, quali la chitinasi. La procedura di produzione necessita tuttavia di ottimizzazione.
|
Abstract
Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMO) are metallo-enzymes recently discovered in bacteria, fungi and arthropods that, through an oxidative mechanism, are able to degrade recalcitrant polysaccharides, such as chitin and cellulose. These enzymes are becoming more and more known and researched in industrial processes and in biorefinery, in fact their efficacy and their auxiliary activity in enzymatic cocktails used for the degradation of lignocellulosic biomasses has been demonstrated. Recently the research on this matter has been based on studies of recombination, expression and purification of these enzymes with the use of E.coli cells and yeasts as expression hosts. With the increase in demand, the attention of studies has focused on new solutions involving new candidates for gene expression, namely algae and in particular the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Algae offer significant advantages, compared to previously used systems and their characteristics (GRAS status, homologous recombination and efficient folding) make them applicable with close study, to every field of industry, from industrial to pharmaceutical and medical. An interesting application is the expression in the chloroplasts of these algae of LPMOs to obtain in the laboratory rapid and efficient protocols for medium and large scale production of these recombinant and purified proteins, and to overcome the costs and timing of previous applications. In this work, the Chlamydomonas reinhardtii TN72 mutated algal strain, obtained in previous thesis work and capable of expressing a form of LPMO, was used. Through microbiology and scalar growth approaches, precise information was obtained on the specific amount of algal biomass that needed to be recovered to detect the presence of the protein in reasonable amounts. Investigation techniques were then performed on SDS-PAGE gels and in WESTERN BLOT and protein purification (DEAE chromatography, AEX). Enzymatic assays (IR spectroscopy) were also performed to verify the efficacy on chitin of the LPMO produced in C. reinhardtii, in order to compare them with the results previously obtained from enzymes purified from E.coli. The obtained protein was made to act in single and in cocktails with other enzymes with auxiliary activity, such as chitinase. However, the production procedure needs optimization.
|
