Riassunto analitico
Muscle differentiation is finely modulated by the synergistic action of two main families of transcription factors: Myogenic Regulatory Factors (MRFs) such as MyoD, Myogenin, Myf5 and MRF4, and the Myocyte Enhancer Factor 2 family of proteins (MEF2), MEF2A- D. The function of these factors is regulated through different mechanisms ranging from alternative splicing to post-translational modification of proteins and interaction with cofactors. Both MRFs and MEF2 proteins are phosphorylated on numerous serine and threonine residues by protein kinases activated by intracellular signaling pathways in response to external stimuli. It has been shown that the function of many phosphorylated proteins is regulated by the enzyme Pin1, a prolyl cis-trans isomerase that, with its N-terminal WW domain, is able to bind proteins phosphorylated on serine or threonine residues followed by a proline and induce reversible cis/trans isomerization with consequent conformational change of the target proteins. Previous studies in our laboratory have shown that Mef2C is a Pin1 target in C2C12 cells, a murine muscle cell line. The consequence of the Pin1/MEF2C interaction is the reduction of MEF2C stability, with inhibition of myogenic differentiation. Pin1 is expressed in skeletal muscle and the protein is particularly abundant in muscle stem cells present in adult muscle, the satellite cells (SC). Since the expression of Pin1 is highest during the first 21 days of life of the mouse, period in which satellite cells are in intense activity to ensure post-natal muscle growth in rodents, we hypothesized that PIN1 might play a role in the function of stem cells. This hypothesis finds support in the analysis of quiescent, proliferating, differentiating or self-renewing SC in fibers isolated from Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of mice KO for Pin1 and WT control mice of about 8 weeks. This analysis showed a lower percentage of MyoD-positive proliferating myoblasts (MyoD +) between the PAX7 + SC after isolation of the fibers from the muscle of KO mice compared to WT. Similar results were obtained by treating SC with All-Trans Retinoic Acid (ATRA), a Pin1 enzyme inhibitor. Since the progression of SC to myoblasts requires the expression of the myogenic determinant MyoD, we investigated whether Pin1 could influence the levels of MyoD protein in the cells. Pin1 was over-expressed or silenced with siRNA in C2C12 cells. From these experiments we found that the levels of MyoD protein change proportionally to the levels of Pin1 expressed in the cell, without significant changes in transcript levels. Comparable results were obtained using Pin1 inhibitors: ATRA, Juglone and Epigallocatechin gallate (EGCG). Co-immunoprecipitation experiments conducted in our laboratory indicate a physical interaction of Pin1 with MyoD, a process that is necessary for Pin1 catalytic activity. Globally these data suggest a stabilizing effect of Pin1 on the MyoD protein, a key factor for cell cycle progression. In light of the results obtained, Pin1 would seem to influence the activity of SC favoring their exit from the quiescent state, probably through a stabilizing action on MyoD. Next, with the aim to study the effects of Pin1 deficiency in vivo we performed cadiotoxin induced muscle regeneration experiments. The preliminary data obtained indicate that muscle regeneration is not inhibited in muscles depleted for Pin1. A second aspect that reflects the activity of SC in vivo is represented by post-natal growth, where instead we found that KO mice have a reduced body weight compared to controls. The lower body weight is, at least partially, due to a reduction in muscle mass: the muscles are composed of a smaller number of fibers with a mean cross sectional area (CSA) lower than that found in control muscles. In summary our data indicate that the activity of Pin1 is important for the myogenic progression of satellite cells in culture and in vivo.
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Abstract
Il differenziamento muscolare è finemente modulato dall’azione sinergica di due principali famiglie di fattori di trascrizione: i Myogenic Regulatory Factors (MRFs) quali MyoD, Miogenina, Myf5 e MRF4, e le proteine della famiglia Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2), MEF2A-D. Sia gli MRFs che le proteine MEF2 sono fosforilate su numerosi residui di serina e di treonina da parte di proteina chinasi attivate da vie di signaling intracellulare in risposta a stimoli esterni. E’ stato dimostrato che la funzione di molte proteine fosforilate viene regolata dall’enzima Pin1, una prolil cis-trans isomerasi che con il suo dominio WW all’N-terminale è in grado di legare residui di Serina o Treonina fosforilati seguiti da una prolina e indurne la isomerizzazione cis/trans reversibile con conseguente cambiamento conformazionale della proteina target. Studi pregressi del nostro laboratorio hanno dimostrato che Mef2C è una proteina bersaglio di Pin1 in cellule C2C12, una linea muscolare murina. Conseguenza dell’interazione Pin1/MEF2C è la riduzione della stabilità di MEF2C, con inibizione del differenziamento miogenico. Pin1 è espresso nel muscolo scheletrico e la proteina è particolarmente abbondante in cellule staminali muscolari presenti nel muscolo adulto chiamate cellule satelliti (SC). Dal momento che l’espressione di Pin1 è massima durante i primi 21 giorni di vita del topo, periodo in cui le cellule satelliti sono in intensa attività per garantire la crescita post-natale del muscolo dei roditori, abbiamo ipotizzato che PIN1 possa svolgere un ruolo importante nella funzione delle cellule staminali. Ipotesi che trova supporto nell’analisi di SC quiescenti, proliferanti, differenzianti o in self-renewal in fibre isolate da muscolo Extensor Digitorum Longus (EDL) di topi KO per Pin1 e WT di circa 8 settimane. Questa analisi ha mostrato una minore percentuale di mioblasti proliferanti MyoD-positivi (MyoD+) tra le SC PAX7+ dopo isolamento delle fibre dal muscolo di topi KO rispetto ai WT. Risultati analoghi sono stati ottenuti trattando le SC con All-Trans Retinoic Acid (ATRA), un inibitore enzimatico di Pin1. Dato che la progressione delle cellule satelliti a mioblasti richiede l’espressione del determinante miogenico MyoD, ci siamo chiesti se Pin1 possa influenzare i livelli di MyoD nelle cellule. Pin1 è stato over-espresso o silenziato con siRNA in cellule C2C12 (linea di mioblasti murini proliferanti). Da questi esperimenti è stato rilevato che i livelli di proteina MyoD cambiano in maniera proporzionale ai livelli di Pin1 espressi nella cellula, senza variazioni significative dei livelli di trascritto. Risultati paragonabili sono stati ottenuti usando inibitori di Pin1: ATRA, Juglone ed Epigallocatechina gallato (EGCG). Esperimenti di co-immunoprecipitazione condotti nel nostro laboratorio indicano una interazione fisica di Pin1 con MyoD, condizione necessaria per lo svolgimento della sua attività catalitica. Globalmente questi dati suggeriscono un effetto stabilizzante di Pin1 sulla proteina MyoD, fattore chiave per la progressione del ciclo cellulare. Alla luce dei risultati ottenuti, Pin1 sembrerebbe influenzare l’attività delle SC favorendone l’uscita dallo stato di quiescenza, probabilmente mediante un’azione stabilizzante su MyoD. Dal momento che Pin1 sembra favorire l’attivazione del pool di SC quiescenti sono stati condotti esperimenti di rigenerazione in topi WT e KO di 3 mesi per studiare l’effetto della mancanza di Pin1 in vivo. I dati preliminari ottenuti indicano che la rigenerazione muscolare non viene inibita in muscoli depleti per Pin1. Un secondo aspetto che riflette l’attività delle SC in vivo è rappresentato dalla crescita post-natale, dove invece abbiamo rilevato che i topi KO hanno un ridotto peso corporeo rispetto ai controlli
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