Riassunto analitico
Il melanoma è la forma più letale di cancro della pelle. Le terapie attualmente disponibili per il melanoma portano beneficio solo ad alcuni pazienti ed in molti casi il tumore diventa resistente al trattamento. Evidenze recenti dimostrano che la capacità delle cellule tumorali di cambiare il proprio fenotipo metabolico sia fra le cause più rilevanti di fallimento terapeutico. A differenza della maggior parte dei tumori che usano la glicolisi, il melanoma utilizza soprattutto la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per produrre energia. Questa peculiarità rende il melanoma un sistema interessante per l’utilizzo di terapie che bloccanol’OXPHOS. Dati recenti del nostro laboratorio, dimostrato che phenformin (phe), un farmaco che blocca l'OXPHOS, inibisce la crescita e l'aggressività delle cellule di melanoma. Nonostante la plasticità metabolica sia una caratteristica fondamentale delle cellule tumorali, i meccanismi molecolari alla base dei cambiamenti metabolici sono ancora largamente sconosciuti. Lo scopo di questa tesi è quello di analizzare gli effetti dell'inibizione dell'OXPHOS sul fenotipo delle cellule di melanoma e di caratterizzare i meccanismi attraverso cui il blocco della respirazione mitocondriale modifica il loro comportamento. A tale scopo, abbiamo riprogrammato il metabolismo delle cellule di melanoma bloccando l'OXPHOS e abbiamo analizzato mediante saggi funzionali e analisi dei profili di espressione genica i cambiamenti associati. Al fine di riprogrammarne il fenotipo, le cellule di melanoma A375 e MNT-1 sono state trattate con dosi crescenti di phe per 1-3 mesi fino alla dose limite di 0,5mM. Le cellule sopravvissute le abbiamo chiamate A375 ed MNT-1 Resistenti (A375R e MNT-1R). Rispetto alle cellule parentali (sensibili, S), le cellule R appaiono più allungate. Le cellule R esprimono alti livelli del marcatore di lenta proliferazione JARID1B e mostrano una ridotta crescita, una diminuzione nella capacità di formare colonie, ed una maggiore apoptosi come dimostrato dall’accumulo delle cellule nella fase Sub-G1 del ciclo cellulare. Inoltre, le cellule A375R sono più positive alla colorazione con β-galattosidasi ed esprimono livelli più alti del marcatore di senescenza p21. Le cellule R sono meno aggressive delle parentali: migrano ed invadono meno ed esprimono minori livelli dei marcatori di aggressività MMP-8 e FN-1. Dal punto di vista metabolico, le cellule R producono meno ATP, consumano meno ossigeno e sono più glicolitiche delle cellule S. Questo fenotipo correla con un aumento della massa mitocondriale (analizzata mediante colorazione con il Mitotraker) e con un aumento dell’espressione dei geni responsabili della biogenesi mitocondriale (analizzata mediante qRT-PCR). E' stata poi eseguita un'analisi di espressione genica mediante Microarray sulle cellule A375S e le A375R. Le possibili connessioni fra i geni differenzialmente espressi sono state analizzate con il programma Ingenuity. Le analisi confermano che, rispetto alle A375S, le A375R up-regolano geni implicati nella risposta immunitaria tra cui emerge per fold-change e rilevanza funzionale l'interleuchina 37 (IL-37). I livelli di IL-37 diminuiscono quando il trattamento con phe viene sospeso parallelamente a una reversione del fenotipo delle cellule R. L'IL-37 inoltre risulta overespressa anche in cellule trattate con phe a tempi brevi, a conferma del suo potenziale ruolo chiave nella riprogrammazione metabolica. Nel loro insieme, questi risultati indicano che le cellule di melanoma, modificano il proprio metabolismo in risposta ad un blocco della fosforilazione ossidativa, che si ripercuote sulla crescita e sull'aggressività tumorale e sulle potenziali interazioni con il micro-ambiente, soprattutto con il sistema immunitario.
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