Riassunto analitico
Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo diffuso, caratterizzato da una perdita di neuroni dopaminergici della Substantia Nigra pars compacta e dalla formazione di aggregati intracellulari di α-sinucleina. Le terapie farmacologiche in uso nel PD sono principalmente sintomatiche, non essendo ancora stati individuati farmaci in grado di arrestare il decorso della malattia. Pertanto, recenti ricerche hanno iniziato a valutare il potenziale terapeutico di estratti vegetali. Nel mio studio, ho testato l’attività dell’olio di noce (Juglans regia L.), estratto tramite spremitura a freddo, ricco di alte percentuali di acidi grassi polinsaturi (PUFA), tra cui l’acido linoleico (LA) e l’acido linolenico (ALA). È stato dimostrato come l’olio di noce (WO) possieda diversi effetti benefici, tra cui: antinfiammatori, antitumorali, antiossidanti, neuroprotettivi, cardioprotettivi e anti-iperlipemici. L’obiettivo del presente studio è stato quello di valutare il possibile effetto neuroprotettivo e antiossidante di WO in modelli in vitro e in vivo di PD, utilizzando la neurotossina Rotenone (ROT). Gli acidi grassi sono stati quantificati tramite analisi in HPLC-UV e LC-MS/MS nel WO, nel terreno nutritivo e nelle teste di Drosophila melanogaster (D.). Per l’esperimento in vitro due linee cellulari umane: cellule microgliali HMC3 e cellule di neuroblastoma SH–SY5Y sono state trattate con ROT e, successivamente, con diverse concentrazioni di WO. Inoltre, per comprendere la possibile azione neuroprotettiva delle cellule microgliali sulle cellule nervose, abbiamo aggiunto alle cellule SH–SY5Y i terreni di coltura condizionati (CM) delle cellule HMC3 precedentemente trattate. La valutazione della vitalità delle cellule sottoposte ai vari trattamenti è stata effettuata mediante test di vitalità a diversi tempi di esposizione. In entrambe le linee cellulari, a concentrazioni efficaci di ROT, la co-somministrazione con WO è risultata in grado di riportare i livelli di vitalità a valori significativamente diversi dalla singola somministrazione di ROT. Il trattamento con alcuni CM delle cellule HMC3 migliora la vitalità delle cellule SH–SY5Y indicando, in tal modo un cross-talk tra microglia e neuroni. Abbiamo infine valutato l’effetto di WO sulla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) da parte delle cellule HMC3, indotto da ROT. L’olio di noce è stato testato anche su modello in vivo di PD (con l’uso di D.) utilizzando il ROT come neurotossina. Per valutare l’attività locomotoria indotta (geotassi negativa), i maschi di D. sono stati esposti, per 7 giorni, a diverse concentrazioni di ROT, WO o associazione tra i due. Al termine degli esperimenti comportamentali sono state separate le teste degli esemplari di D. al fine di valutarne variazioni dei livelli di acidi grassi indotti dai trattamenti. Nella geotassi negativa, le D. trattate con WO non differiscono, nei livelli di “climbing”, dai controlli, e sono significativamente superiori rispetto a quelle trattate con ROT. Quando le D. sono state trattate contemporaneamente con ROT e WO, la capacità di “climbing” è significativamente migliorata rispetto a quella delle D. esposte al solo ROT. Le teste di D. cresciute nel mezzo arricchito con WO mostrano un aumento significativo di ALA. L’associazione di WO con ROT riporta il contenuto cefalico di ALA a quello dei trattati con WO, esercitando un potenziale protettivo a livello cerebrale. La maggiore assunzione di WO nella dieta determina una presenza più elevata di ALA nelle teste di D. e indica fortemente il ruolo protettivo di questo omega 3 nei confronti della neurotossicità indotta da ROT. I nostri risultati consentiranno la valorizzazione di questo olio vegetale, per il suo alto contenuto di PUFA e la definizione di un suo uso nutraceutico nella prevenzione della neurodegenerazione.
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Abstract
Parkinson's disease (PD) is a widespread neurodegenerative disorder characterized by a loss of dopaminergic neurons of the Substantia Nigra pars compacta and the formation of intracellular aggregates of α-synuclein. The pharmacological therapies used in PD are mainly symptomatic since drugs capable of arresting the course of the disease have not yet been identified. Therefore, recent researches have begun to investigate the therapeutic potential of plant extracts. In my study, I tested the activity of walnut oil (Juglans regia L.), extracted by cold pressing, rich in high percentages of polyunsaturated fatty acids (PUFA), including linoleic acid (LA) and l linolenic acid (ALA). Walnut oil (WO) has been shown to have several beneficial effects, including anti-inflammatory, anticancer, antioxidant, neuroprotective, cardioprotective and anti-hyperlipemic ones. The aim of the present study was to evaluate the possible neuroprotective and antioxidant effect of WO in in vitro and in vivo models of PD, using the neurotoxin Rotenone (ROT). Fatty acids were quantified by HPLC-UV and LC-MS/MS analysis in WO, in nutrient medium and in the heads of Drosophila melanogaster (D.). For the in vitro experiment, two human cell lines: HMC3 microglial cells and SH–SY5Y neuroblastoma cells were treated with ROT and, subsequently, with different concentrations of WO. Furthermore, to understand the possible neuroprotective action of microglial cells on neuron-like cells, we added conditioned culture media (CM) from previously treated HMC3 cells to SH–SY5Y cells. The evaluation of the viability of cells subjected to the various treatments was carried out by means of proper viability tests at different exposure times. In both cell lines, at effective concentrations of ROT, co-administration with WO was able to bring the viability levels back to values significantly different from the administration of ROT alone. Treatment of HMC3 cells with some CMs improves the viability of SH–SY5Y cells, thus indicating a crosstalk between microglia and neurons. We finally evaluated the effect of WO on the production of reactive oxygen species (ROS) by HMC3 cells, induced by ROT. Walnut oil has also been tested on an in vivo model of PD (with the use of D.) using ROT as a neurotoxin. To evaluate the induced locomotor activity (negative geotaxis), D. males were exposed, for 7 days, to different concentrations of ROT, WO, or a combination between the two. At the end of the behavioral experiments, the heads of the D. specimens were separated to evaluate changes in fatty acid levels induced by the treatments. In negative geotaxis, the D. treated with WO do not differ in climbing levels from the controls and are significantly higher than those treated with ROT. When D. were treated simultaneously with ROT and WO, the climbing ability significantly improved compared to that of D. exposed to ROT alone. D. heads grown in WO-enriched medium show a significant increase in ALA. The association of WO with ROT brings the cephalic ALA content back to that of the ones treated with WO, exerting a protective potential at the brain level. The greater intake of WO in the diet determines a higher presence of ALA in D. heads and strongly indicates the protective role of this omega 3 fatty acids against ROT-induced neurotoxicity. Our results will allow the valorization of this vegetable oil, due to its high PUFA content, and the definition of its nutraceutical use in the prevention of neurodegeneration.
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