Riassunto analitico
Nel 2008 il mercato italiano degli integratori alimentari vantava un valore di 1.3 miliardi di euro. Ad oggi, grazie all’aumento dell’attenzione rispetto alla salute da parte della popolazione, alla maggiore facilità con cui si può accedere all’acquisto di integratori alimentari tramite farmacie, parafarmacie e il commercio online ed anche grazie all’aumento del consiglio, da parte di medici e farmacisti, si è arrivati a triplicare questo valore raggiungendo la cifra di 3.8 miliardi di euro. Per integratori alimentari si intendono i prodotti alimentari destinati ad integrare la dieta normale e che costituiscono una fonte concentrata di sostanze nutritive o di altre sostanze aventi un effetto nutritivo o fisiologico. In Italia, tra i primi 10 tipi di integratori più usati troviamo gli integratori a cui vengono deputate azioni benefiche per il sistema cardiocircolatorio, ad esempio, quelli a base di monacolina K, berberina e resveratrolo, e integratori che risultano avere effetti benefici su muscoli e articolazioni, ad esempio, quelli a base di acidi boswellici. A causa della forte crescita del mercato degli integratori alimentari, sorge la necessità di un maggiore controllo di quest’ultimi, in modo da garantirne la qualità sia in termini di sicurezza che di contenuto e quindi di efficacia degli stessi. In particolare, per gli integratori suddetti, risulta importante rispettare le disposizioni di legge per quanto riguarda gli integratori alimentari contenenti monacolina K successivamente alla variazione dei livelli massimi di assunzione giornaliera, passati da 10mg/die a 3mg/die. Nel caso invece degli integratori contenenti acidi boswellici, i metodi che vengono solitamente utilizzati per la loro quantificazione si basano su titolazioni acido-base che risultano essere viziate dalla presenza di altri acidi, come gli acidi ursolici, negli estratti. Nel presente progetto di tesi sono pertanto stati presi in considerazione integratori alimentari contenenti monacolina K, berberina, resveratrolo e acidi boswellici. In letteratura per la loro quantificazione sono principalmente presenti metodi separativi. Tuttavia, questi risultano avere vari svantaggi se confrontati a tecniche innovative come la risonanza magnetica nucleare quantitativa (qNMR). L’obiettivo del progetto è sviluppare, ottimizzare e validare un metodo di estrazione e quantificazione mediante qNMR, secondo il metodo ERETIC2. Per ogni singolo composto attivo, si è dapprima sviluppato ed ottimizzato un metodo estrattivo. Successivamente, si è proceduto effettuando un’analisi qualitativa in NMR, degli estratti mediante sequenze mono- e bidimensionali per la corretta identificazione ed assegnazione dei segnali delle molecole di interesse. Infine, si è ottimizzata la sequenza di acquisizione per la quantificazione dei singoli composti sia al protone che al carbonio utilizzando la piridossina come standard ERETIC. Il metodo è stato successivamente validato in termini di: precisione dello strumento intra- e inter-day su ogni composto attivo, CV% < 1% e 10% rispettivamente; ripetibilità del metodo estrattivo, CV% < 5%; recupero > 90%; LOD e LOQ, calcolati su spettri 1H-NMR, rispettivamente per monacolina K, 0.0063 mg e 0.0167 mg; berberina, 0.0068 mg e 0.0163 mg; resveratrolo, 0.0058 mg e 0.0140 mg; e su spettri 13C-NMR, per acidi boswellici, < 0.15 mg e < 0.45 mg. Una volta ottimizzato e validato il metodo si è proceduto ad analizzare alcuni campioni commerciali e i risultati ottenuti hanno messo in evidenza le problematiche del mondo degli integratori. Infatti, si sono innanzitutto notate differenze nei contenuti di unità posologiche provenienti anche dallo stesso lotto. In un caso si è anche evidenziata l’assenza completa dei principi attivi dichiarati in etichetta.
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Abstract
The Italian food supplement market was esteemed at 1.3 billion euros in 2008, and in 15 years was 3-fold increased. The increment was induced by the greater attention of people to well-being and easier attainability of food supplements through pharmacies, over-the-counter pharmacies, markets, and e-commerce shops under doctor and pharmacist recommendations. Food supplements are defined as food products intended for integrating the diet, being a concentrated source of nutrients or other substances with a nutritional or physiological effect. In Italy, food supplements with benefic effects on the cardiovascular system (e.g., containing monacolin k, berberine, and resveratrol) or on joints and muscles (e.g., containing boswellic acids) are among the top ten most used. Due to the fast rising of the market, the quality control of food supplements is gaining more and more relevance to ensure consumers’ safety and reproducible active compound content and efficacy. In particular, conformity to legislation is essential in the case of food supplements containing monacolin K, whose maximum levels of daily intake decreased from 10mg/die to 3mg/die. Besides, the quality control of food supplements containing boswellic acids is required since their content in the raw extracts is usually estimated through acid-base titration methods, which are affected by the presence of other organic acids (e.g., ursolic acids). Thus, in the present thesis project, food supplements containing monacolin k, berberine, resveratrol, and boswellic acids were considered. In the literature, these active compounds are mainly quantified through separative methods. Nevertheless, these analytical methods display several drawbacks compared to novel advanced techniques, such as quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy (qNMR). The aim of the project was the development, optimization, and validation of the extractive method, and qNMR quantification through the ERETIC2 technique. Firstly, the extraction of each active compound was developed and optimized. Subsequently, qualitative analyses in NMR were carried out on extracts through both 1D and 2D pulse sequences for correctly identifying and assigning the resonances of the target compounds. Then, the NMR pulse sequence for the quantification of each active compound was optimized both on proton and carbon spectra, using pyridoxine as the external ERETIC standard. Finally, the method was validated in terms of intra- and inter-day precision, CV% < 1% and 10% respectively; repeatability of the extraction method, CV% < 5%; recovery > 90%. The LOD and LOQ were determined on 1H-NMR spectra respectively for monacolin K, 0.0063 mg and 0.0167 mg; berberine, 0.0068 mg, and 0.0163 mg; resveratrol, 0.0058 mg, and 0.0140 mg; and on 13C-NMR spectra for boswellic acids, < 0.15 mg and < 0.45 mg. Once optimized and validated the method, several commercial samples were analyzed, and the results showed the problems of the food supplement world. Indeed, dosage units belonging to the same batch displayed different contents in active compounds. Additionally, the complete absence of the active compounds declared on the label was highlighted in one food supplement.
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